吴亮亮, 常莹莹, 邓子新, 刘天罡

合成生物学 2022, 3 (6): 1277-1291. DOI:10.12211/2096-8280.2022-004

摘要（1292）

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庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，在临床上广泛应用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染。它可由棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora产生，生物合成途径清晰。为了提高庆大霉素的产量，本文以工业菌株M. echinospora J1-020为基础，确定庆大霉素合成基因簇信息，建立了稳定的遗传操作方法。在此基础上，使用强（kasOp*）、中（rpsLp-cf）、弱（ermE*）三种强度的启动子评估磷酸转移酶GenP的最适过表达水平，构建对应attB/attP位点整合突变株YC002、YC003、YC001。摇瓶发酵结果显示，YC001、YC002、YC003菌株的庆大霉素C组分的产量较原始菌株［（1008±57） mg/L］分别提高了16.9%［（1178±39） mg/L］、30.8 %［（1319±29） mg/L］和18.8 %［（1198±46） mg/L］；同时，结合杂质含量，在以上三株菌株中确定了中强度启动子控制genP过表达的效果最佳，以此构建对应的稳定整合在基因组上的genP过表达菌株YC004。使得庆大霉素C组分摇瓶发酵产量提高了34.5 %［（1427±37） mg/L］。此外，以工业菌株M. echinospora J1-020为底盘，构建genQ敲除菌株，获得了只产生G418单一组分的菌株YC005，其摇瓶发酵产量为460 mg/L。以YC004为出发菌株，依次敲除genB4、genK，获得了只产生西索米星单一组分的菌株YC007，其摇瓶发酵产量达1046 mg/L。综上，以该工业菌株M. echinospora J1-020为底盘，借助合理的代谢工程策略有望快速获得多种氨基糖苷类抗生素的高产菌株。

以attB/attP位点整合得到的突变株在无抗生素添加的情况下传代易回复至野生型从而导致产量的不稳定甚至下降，但添加抗生素以维持菌株稳定不利于大规模工业化生产。所以，需要将目的基因稳定重组至菌株染色体上。综合2.3.1中突变株的产量测定结果，genP的过表达有利于庆大霉素的产量提升，同时，由于杂质庆大霉素C2b在液相分离中出峰时间位于庆大霉素C2与C2a之间，后期分离纯化中无法去除，所以需要在发酵中控制其百分含量在《中国药典》要求范围内（百分含量≤3%）。菌株M. echinospora J1-020、YC002、YC003、YC001庆大霉素C2b含量分别为2.15%、3.15%、2.8%、3.35%，可见中强度启动子rpsLp-cf控制GenP的表达更佳，其庆大霉素C2b杂质含量较低。以此，通过同源重组方式构建中强度启动子rpsLp-cf控制genP过表达的突变株YC004［图3（a）、（b）］，发酵及产量测定结果显示，YC004菌株庆大霉素C组分（C1、C1a、C2、C2a）产量［（1427±37） mg/L］较野生型菌株M. echinospora J1-020［（1061±37） mg/mL］提高了34.5%，庆大霉素C2b含量2.3%符合要求［图3（c）］。同时，对比各组分产量变化，庆大霉素C1a、C2a及西索米星产量提升明显，庆大霉素C1、C2、C2b未有明显变化［图3（d）］，由此可以推测庆大霉素 C1a、C2a下游途径相关酶GenL和GenB2表达量较低，未能进一步转化底物。

基于已建立的高效遗传操作方法，本研究分别使用过表达genP、敲除genQ、双敲除genB4和genK的策略直接且快速地获得了高产庆大霉素C、G418以及西索米星单一组分的工业棘孢小单孢菌突变株。在未来，以M. echinospora J1-020工业生产菌株为底盘，通过简单的代谢工程策略便有望高效合成具有高市场价值的其他氨基糖苷类抗生素，借助其明确的全基因组信息、高效的遗传操作系统和中间体、产物合成能力，可以开展许多工作，如可通过敲除genK和genP，过表达内源的2'-NH₂向2'-OH转化基因genR和genS［30］，实现二代氨基糖苷类抗生素异帕米星的前体庆大霉素B的高效合成；同时，基于庆大霉素和卡那霉素的结构相似性，对庆大霉素和卡那霉素进行基因和生化分析的报道显示，在它们的合成基因簇中有许多酶的蛋白同源性很高，而且卡那霉素工业菌株具有更高的生产能力，其相关酶的催化活性可能更高［31］，因此，可通过引入外源的卡那霉素合成相关同源酶以增加前体和底物转化（如过表达2′-NH₂向2′-OH转化相关酶KanJ和KanK［30］、过表达糖基转移酶KanM1［31］和过表达J1-20A向下游转化的脱氢酶KanQ和氨基转移酶KanB等），进一步提高庆大霉素B的产量；还可以通过基因genK、genL的敲除，得到单一C组分——庆大霉素C1a，提高其含量，增加庆大霉素C组分的杀菌效力，减少毒副作用等［32］。