基于合成生物学策略的酶蛋白元件规模化挖掘
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张建志, 付立豪, 唐婷, 张嵩亚, 朱静, 李拓, 王子宁, 司同
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Scalable mining of proteins for biocatalysis via synthetic biology
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ZHANG Jianzhi, FU Lihao, TANG Ting, ZHANG Songya, ZHU Jing, LI Tuo, WANG Zining, SI Tong
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表 2 基因高通量克隆、组装方法
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Tab. 2 Methods for high-throughput gene cloning and assembly
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| 分类 | 原理 | 特点 |
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| 限制性内切酶克隆系统 | 限制性内切酶使基因片段和载体产生黏性末端， 通过T4连接酶组装 | 1.普通的双限制性内切酶克隆操作简单，但需考虑目的基因序列中酶切位点序列，适合单基因克隆； 2.稀有限制性内切酶SgfⅠ和PmeⅠ使其具备高通量操作的可行性； 3.Golden Gate可同时实现多片段酶切与模块化组装，但也需要移除目的序列中的BsaⅠ及BsmBⅠ等识别位点； 4.MASTER只能识别甲基化的4bp位点，无需考虑目的基因序列是否含有MspJⅠ识别位点序列 | BioBrick BglBck ePath Brick Flexi cloning Golden Gate system MASTER | | 同源重组克隆系统 | 基于基因片段与载体两端的同源序列进行克隆 组装 | 1.操作简单、效率高、快速、稳定，适合单基因或多基因组装； 2.无限制性内切酶和连接酶的参与； 3.无需考虑目的基因序列内部的酶切位点； 4.存在重复序列时难以组装 | Gibson assembly OE-PCR CPEC SLIC NE-SLIC USER Gateway cloning Echo cloning Creator 酵母胞内DNA组装 枯草芽孢杆菌胞内DNA组装 大肠杆菌胞内DNA组装 | | 基于寡核苷酸的架桥法克隆系统 | 基于热稳定的连接酶和寡核苷酸进行DNA组装 | 在相似的反应条件下（12个DNA片段的组装），连接反应的保真性与酵母胞内DNA组装方法相近，并高于CPEC和Gibson等方法 | | LCR | | 基于CRISPR的克隆系统 | 基于Ⅱ类type Ⅴ CRISPR系统和Taq DNA连 接酶开发的DNA无缝拼接方法 | 仅需Cpf1一种内切酶进行切割，经过条件优化或蛋白改造，连接效率可达到70%以上，并可实现21kbp长度的DNA组装 | CCTL iCOPE |
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