稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) | RNP | 利用磷酸钙矿化的纳米颗粒承载RNP与原生质体共培养 | 体外表达并组装成有功能的RNP | — | — | NHEJ,中断编码Sytalone dehydratase的sdh基因的效率为20%[23] |
水稻恶苗病菌(Fusarium fujikuroi) | 质粒 | PEG介导的原生质体转化 | 内源表达水稻恶苗病菌密码子优化的Cas9,并用RNA聚合酶II型启动子加上自我剪切核酶的方式、RNA聚合酶III型U6或5S rRNA启动子分别表达gRNA | — | — | NHEJ, RNA聚合酶II型启动子加上自我剪切核酶的方式表达gRNA时,不能获得Fusarium cyclin C1编码基因fcc1的基因编辑突变体;用RNA聚合酶III型U6和5S rRNA启动子表达gRNA时, fcc1中断效率分别是37.5%和79.2%[38] |
嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila) | PCR产物 | PEG介导的原生质体转化 | 内源表达密码子优化的Cas12a并用U6启动子驱动gRNA的表达 | PCR产物;两端靠近CRISPR-Cas切口处分别有500~600 bp的同源臂,中间包含抗性筛选标记基因表达盒 | — | HDR,编辑单基因的效率为90%;编辑多个基因时,单基因发生编辑的效率为13%~41%[35]; |
黑曲霉(Aspergillus niger) | 质粒 | PEG介导的原生质体转化 | 利用可自主复制并丢失的质粒装载CRISPR-Cas系统,RNA聚合酶II型启动子加核酶的形式表达gRNA | 质粒;插入片段两侧有CRISPR-Cas在基因组上产生切口附近的同源臂,同源臂两侧有和CRIPSR-Cas在基因组上识别区域一致的spacer | pyrG基因中断菌株 | 每转1 μg DNA获得2个有正确整合形式的转化子[25] |
黑曲霉(Aspergillus niger) | 质粒 | — | 融合表达大鼠的胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1、黑曲霉密码子优化的nCas9和尿嘧啶糖基化抑制酶,用米曲霉U6启动子驱动gRNA的表达 | — | — | 将靶基因中特定位置的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶,效率47.36%~100%[31] |
黑曲霉(Aspergillus niger) | 质粒 | PEG介导的原生质体转化 | 利用黑曲霉密码子优化的Cas9和内源5S rRNA基因启动子驱动gRNA的表达 | PCR产物;两端和CRISPR-Cas切口处分别有40 bp的同源臂 | kusA缺陷型菌株 | HDR,效率为33.3%~100%[47] |
黑曲霉(Aspergillus niger) | 质粒 | PEG介导的原生质体转化 | 利用可自主复制的质粒装载CRISPR-Cas系统,内源表达Cas9,并用tRNA基因启动子驱动gRNA的表达 | 60 bp的寡核苷酸链,突变位点和PAM的距离不超过15 bp | kusA缺陷型菌株 | HDR,效率为80%[56] |
烟曲霉(Aspergillus fumigatus) | 质粒和RNA | PEG介导的原生质体转化 | 内源表达人密码子优化的Cas9和体外转录gRNA | PCR产物;两端靠近CRISPR-Cas切口处分别有35 bp的同源臂 | — | HDR,效率为95%~100%[53] |
里氏木霉(Trichoderma reesei) | 质粒和RNA | PEG介导的原生质体转化 | 内源表达里氏木霉优化的Cas9和体外转录成熟的gRNA | 质粒;两端和CRISPR-Cas切口处分别有200 bp的同源臂 | 以表达Cas9的菌株为出发菌株 | HDR,编辑内源一个假定的甲基转移酶基因lae1的效率为93%[14] |
灵芝 (Ganoderma lucidum) | 质粒 | PEG介导的原生质体转化 | 利用灵芝密码子优化的Cas9和内源U6启动子驱动gRNA的表达,在gRNA 3′端加入HDV | PCR产物;两端和CRISPR-Cas切口处分别有1 kb的同源臂,中间缺失包括PAM在内的8 bp并引入终止密码子TGA | — | HDR,编辑细胞色素P450编码基因cyp5150l8的效率为每转化3×107个原生质体获得2个基因编辑菌株[15] |