CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展

滕小龙, 史硕博

Optimization and development of CRISPR/Cas9 systems for genome editing

TENG Xiaolong, SHI Shuobo

表2 CRISPR/Cas9系统融合效应蛋白带来功能优化

Table 2 Functional optimization through fusion expression of effector proteins with CRISPR/Cas9 system

功能 效应蛋白或gRNA工程 系统 特征 参考文献 表达调控 无 dCas9 原核生物基因抑制表达，真核生物基因抑制效率低 [22] KRAB，MXI1，TUP1抑制结构域 dCas9 可在真核生物中抑制基因表达 [62-63] KRAB-MeCP1融合抑制结构域 dCas9 在哺乳动物细胞中高效抑制目的基因表达 [64] p65，VP64激活结构域 dCas9 激活基因表达，效率较低 [65-66] VP64-p65-Rta（VPR）融合激活结构域 dCas9 与VP64相比提高了22～320倍；多重基因激活表达；刺激iPSCs神经元分化 [67] gRNA工程；gRNA上携带携带两个MS2发夹二级结构 dCas9 每个发夹结构招募一个MS2-p65-HSF1融合激活蛋白；与VP64相比，使10个靶基因上调2倍以上 [68] SPY系统（包括SpyTag和SpyCatcher）和Med2激活结构域 dCas9 招募多拷贝SpyCatcher和Med2融合蛋白使酿酒酵母目的基因表达提高34.9倍 [69] SunTag系统（包括GCN4肽和抗GCN4抗体的单链可变片段scFv）和MIG1抑制结构域 dCpf1 招募多拷贝ScFv与MIG1融合蛋白使酿酒酵母目的基因受到95%的抑制 [69] 表观基因组编辑 KRAB-DNA甲基化酶催化结构域融合蛋白 dCas9 融合抑制因子和甲基化酶；造成目的基因78%的稳定沉默 [70] 两侧分别融合KRAB和Dnmt3A-Dnmt3L融合DNA甲基化酶结构域 dCas9 在干细胞分裂分化为神经细胞后仍维持DNA甲基化和基因抑制 [71] TET1甲基胞嘧啶双加氧酶1催化结构域 dCas9 dCas9- TET1靶向至BRCA1基因启动子后成功地上调其表达水平 [72] 人类组蛋白乙酰基转移酶p300催化核心 dCas9 催化组蛋白H3 第27位赖氨酸残基的乙酰基化；基因表达上调 [73] 单碱基编辑 胞嘧啶脱氨酶，腺嘌呤脱氨酶 nCas9 在不造成DNA双链断裂的条件下使目的碱基产生C:G与T:A或A:T与G:C的碱基对替换 [30,74-75] CBE-UGI融合蛋白 nCas9 UGI能够防止胞嘧啶C脱氨后的尿嘧啶U被切除，从而显著提高了CBEs的编辑效率 [30] 单链DNA结合结构域ssDBD融合到胞嘧啶脱氨酶与nCas9之间 nCas9 通过延长ssDNA的暴露时间极大地提高CBEs的编辑效率；使CBEs的编辑窗口范围得到了提高 [76] 组合nCas9、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶 nCas9 首次实现大肠杆菌中C到A 87.2%和哺乳动物细胞C到G 5.3%至53.0%的编辑效率 [77] 先导编辑 通过gRNA工程改造的pegRNA；与逆转录酶融合 nCas9 改变pegRNA可实现精确的碱基替换、基因敲除和插入 [27] 通过gRNA工程改造的pegRNA；与逆转录酶和Rad51融合 nCas9 融合单链DNA结合蛋白Rad51使PE2的编辑效率最高提升2.6倍 [78]