吴亮亮, 常莹莹, 邓子新, 刘天罡

合成生物学 2022, 3 (6): 1277-1291. DOI:10.12211/2096-8280.2022-004

摘要（1298）

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庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，在临床上广泛应用于治疗由革兰氏阴性菌引起的严重感染。它可由棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora产生，生物合成途径清晰。为了提高庆大霉素的产量，本文以工业菌株M. echinospora J1-020为基础，确定庆大霉素合成基因簇信息，建立了稳定的遗传操作方法。在此基础上，使用强（kasOp*）、中（rpsLp-cf）、弱（ermE*）三种强度的启动子评估磷酸转移酶GenP的最适过表达水平，构建对应attB/attP位点整合突变株YC002、YC003、YC001。摇瓶发酵结果显示，YC001、YC002、YC003菌株的庆大霉素C组分的产量较原始菌株［（1008±57） mg/L］分别提高了16.9%［（1178±39） mg/L］、30.8 %［（1319±29） mg/L］和18.8 %［（1198±46） mg/L］；同时，结合杂质含量，在以上三株菌株中确定了中强度启动子控制genP过表达的效果最佳，以此构建对应的稳定整合在基因组上的genP过表达菌株YC004。使得庆大霉素C组分摇瓶发酵产量提高了34.5 %［（1427±37） mg/L］。此外，以工业菌株M. echinospora J1-020为底盘，构建genQ敲除菌株，获得了只产生G418单一组分的菌株YC005，其摇瓶发酵产量为460 mg/L。以YC004为出发菌株，依次敲除genB4、genK，获得了只产生西索米星单一组分的菌株YC007，其摇瓶发酵产量达1046 mg/L。综上，以该工业菌株M. echinospora J1-020为底盘，借助合理的代谢工程策略有望快速获得多种氨基糖苷类抗生素的高产菌株。

基因的过表达，往往需要考虑其表达强度与整个合成途径的代谢平衡，而表达强度的控制可以借助不同强度的启动子来实现［25］。在以往的工作中，已经在M. echinospora中表征了一系列不同强度的组成型启动子［20］，以此为依据，选择强（kasOp*）、中（rpsLp-cf）、弱（ermE*）三种强度的启动子来进行genP的过表达，构建对应attB/attP位点整合突变株YC002、YC003、YC001［图2（a）］，以确定合适的表达强度。对于硫酸庆大霉素产品，庆大霉素C1、C1a、C2、C2a为主要成分，西索米星、庆大霉素C2b为杂质。发酵及产量检测结果显示，YC002、YC003、YC001菌株庆大霉素C组分（C1、C1a、C2、C2a）产量较野生型菌株M. echinospora J1-020［（1008±57） mg/L］分别提高了30.8%［（1319±29） mg/L］、18.8%［（1198±46） mg/L］、16.9%［（1178±39） mg/L］，可见启动子强度越强，GenP表达量越高，庆大霉素C组分（C1、C1a、C2、C2a）产量提升越明显［图2（b）］。

硫酸庆大霉素制剂已应用于临床治疗革兰氏阴性菌感染数十年，其工业生产菌株M. echinospora J1-020的庆大霉素C组分（C1、C1a、C2、C2a）产量约1000mg/L，为了进一步提高该底盘菌株合成庆大霉素以及其前体的能力，本文首先对此工业菌株进行了全基因组测序，定位了庆大霉素生物合成基因簇，并通过二亲本、三亲本接合转移条件摸索，建立了三亲本遗传操作体系，其中，质粒pYH7由于其结构稳定、遗传不稳定性，在接合子松弛传代培养的第一、二代就可以筛选到相应的突变株，说明使用pYH7为载体的三亲本遗传操作体系可以用于此工业菌株突变株的快速获得。以此为基础，进行了J1-20A和J1-20B脱去羟基的关键基因genP的过表达，首先使用强（kasOp*）、中（rpsLp-cf）、弱（ermE*）三种强度的启动子进行attB/attP位点整合的过表达菌株的构建，测定综合产量和杂质含量后，确定了中强度启动子更适合于genP的过表达，进而构建了稳定重组在菌株染色体上的genP过表达突变株YC004。在摇瓶发酵水平上，突变株YC004的庆大霉素C组分（C1、C1a、C2、C2a）产量较野生型菌株M. echinospora J1-020提高了34.5%。同时，本文进行了genQ敲除突变株YC005的构建，以获得G418单一组分，G418产量由37 mg/L提高至460 mg/L。最后，以genP过表达菌株YC004为出发菌株，依次敲除genB4、genK，构建了双敲除突变株YC007从而获得单一组分西索米星以及其少量甲基化产物，经过摇瓶发酵，结果显示，YC007西索米星的产量比对照菌株YC004产量提升了约21倍，达到了1046 mg/L。后续，以庆大霉素C高产菌株YC004为基础，可通过下游相关酶GenB1、GenB2、GenB4的高效表达（图1），实现庆大霉素C组分产量的进一步提升；以YC005菌株为基础，结合传统的随机突变［25］和理性的代谢工程改造（如前体供应相关基因的过表达），有望实现G418的产量提升，应用于工业化生产。

基于已建立的高效遗传操作方法，本研究分别使用过表达genP、敲除genQ、双敲除genB4和genK的策略直接且快速地获得了高产庆大霉素C、G418以及西索米星单一组分的工业棘孢小单孢菌突变株。在未来，以M. echinospora J1-020工业生产菌株为底盘，通过简单的代谢工程策略便有望高效合成具有高市场价值的其他氨基糖苷类抗生素，借助其明确的全基因组信息、高效的遗传操作系统和中间体、产物合成能力，可以开展许多工作，如可通过敲除genK和genP，过表达内源的2'-NH₂向2'-OH转化基因genR和genS［30］，实现二代氨基糖苷类抗生素异帕米星的前体庆大霉素B的高效合成；同时，基于庆大霉素和卡那霉素的结构相似性，对庆大霉素和卡那霉素进行基因和生化分析的报道显示，在它们的合成基因簇中有许多酶的蛋白同源性很高，而且卡那霉素工业菌株具有更高的生产能力，其相关酶的催化活性可能更高［31］，因此，可通过引入外源的卡那霉素合成相关同源酶以增加前体和底物转化（如过表达2′-NH₂向2′-OH转化相关酶KanJ和KanK［30］、过表达糖基转移酶KanM1［31］和过表达J1-20A向下游转化的脱氢酶KanQ和氨基转移酶KanB等），进一步提高庆大霉素B的产量；还可以通过基因genK、genL的敲除，得到单一C组分——庆大霉素C1a，提高其含量，增加庆大霉素C组分的杀菌效力，减少毒副作用等［32］。