章益蜻, 刘高雯

合成生物学 2025, 6 (3): 685-700. DOI:10.12211/2096-8280.2024-079

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合成生物学作为一门通过设计、构建和改造生物系统来实现其特定功能的学科，被广泛应用于生物制造、环境保护和药物合成等领域。基因功能的系统性探索和工程菌株文库的构建是推动合成生物学发展的重要手段。本文重点介绍了不同酵母文库在合成生物学中的构建方法及其应用前景。随着基因组测序和高通量技术的快速进展，酿酒酵母和裂殖酵母等微生物文库在系统性研究中发挥了关键作用。基因缺失文库、过表达文库、转座子插入文库等多种类型的酵母文库为基因组合优化和代谢路径设计提供了重要工具，促进了代谢工程和合成生物学的创新应用。这些文库在工业生产中支持高产菌株的构建，如用于生物燃料和化学品的高效生产；在环境领域，通过基因改造筛选，生成具备污染物降解能力的菌株，为生态修复提供解决方案；在药物合成方面，文库帮助构建高效合成药用化合物的菌株，推动生物制药的发展。然而，当前文库构建和应用仍面临诸如构建成本、基因组编辑的精确度及筛选效率等技术瓶颈。未来，自动化、数字化和新型筛选技术的进步有望突破这些瓶颈，推动酵母文库的快速构建和高效筛选，从而加速合成生物学在可持续发展和生态工程中的应用。

图1 经典文库构建方法（本图由biorender绘制）
［（a）基因缺失文库中，目的基因ORF（橘色片段）被替换成卡那霉素抗性筛选标签KanMX（黄色片段），两侧伴有“分子条形码”barcode（蓝色片段）；Chr.DNA：染色体DNA。（b）Bar-seq原理示意图。在特定条件处理下，目标菌株（红色）的生长量相对低（淡粉色），表现为测序时相应barcode的读数量相对低（红色线条比其他颜色少）。（c）基因过表达文库中，目的基因ORF（橘色片段）除了在基因组上正常表达之外，还额外在质粒上由通用型启动子（淡绿色片段）驱动表达。（d）ORF-Tag文库中，在删除终止密码子的目的基因ORF（橘色片段）C端插入荧光蛋白GFP（深绿色片段）和筛选标签KanMX（黄色片段）］

酵母单基因缺失文库［16-18］中，每个菌株中被删除的目的基因ORF都通过同源重组法被替换成了一个卡那霉素抗性筛选标签（kanamycin modular expression，KanMX），并且两侧有一对长度为20 bp的序列各不相同的标签，被称为“分子条形码”（barcode）［图1（a）］。这些条形码能够准确、唯一地识别每个缺失突变体，这使高通量的定量平行分析成为可能，为全面、快速、经济、便捷地筛查各个生物学方面的基因功能奠定了基础［19-20］。每个基因缺失菌株携带的独特的分子条形码大大简化了在同一实验条件下对多个突变体进行平行分析的过程。例如为了筛选对生长重要的基因，通过一次实验，将所有单基因缺失菌株混合培养，并在生长过程中定期采集样本。从这些样本中提取基因组DNA，通过扩增与每个单基因缺失菌株相关联的分子条形码。即可根据该基因的丰度判断此基因对生长的重要性。对生长越重要，相应缺失菌株的分子条形码在培养过程中就减少得越快。因此，所有目的基因都可以在一次实验中被识别出来，并按照它们对适应度的相对贡献进行排序［图1（b）］。

全基因组过表达文库通过将一系列携带额外目的基因拷贝的质粒载体与强启动子相结合［图1（c）］，强制性提高每个基因的表达水平，来研究基因在细胞生长、代谢通路及应激反应中的作用。质粒上的启动子通常是诱导性的，如gal1启动子［21］或nmt1启动子［22］，在半乳糖碳源或去除硫胺素的条件下可以诱导有该启动子的基因强表达，这使得研究人员能够在特定条件下调控基因表达从而观察表型变化。

ORF-Tag文库通过在基因的C端或N端插入荧光标签标记目标蛋白。它有两种模式：一种是在各个基因的原生位点进行修饰［图1（d）］；另一种则是在一个异位位点上额外表达融合蛋白。前者保证了目标蛋白的表达水平和模式受到的干扰最小；后者往往涉及基因过表达，一些在正常状态下不表达的基因产物也能够通过诱导表达在细胞内进行定位。但与此同时，融合蛋白的非生理表达可能导致其定位错误，对于一些剂量敏感型蛋白还可能造成细胞内分子成分之间平衡的扰动或紊乱，影响细胞正常生理活动。