章益蜻, 刘高雯

合成生物学 2025, 6 (3): 685-700. DOI:10.12211/2096-8280.2024-079

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合成生物学作为一门通过设计、构建和改造生物系统来实现其特定功能的学科，被广泛应用于生物制造、环境保护和药物合成等领域。基因功能的系统性探索和工程菌株文库的构建是推动合成生物学发展的重要手段。本文重点介绍了不同酵母文库在合成生物学中的构建方法及其应用前景。随着基因组测序和高通量技术的快速进展，酿酒酵母和裂殖酵母等微生物文库在系统性研究中发挥了关键作用。基因缺失文库、过表达文库、转座子插入文库等多种类型的酵母文库为基因组合优化和代谢路径设计提供了重要工具，促进了代谢工程和合成生物学的创新应用。这些文库在工业生产中支持高产菌株的构建，如用于生物燃料和化学品的高效生产；在环境领域，通过基因改造筛选，生成具备污染物降解能力的菌株，为生态修复提供解决方案；在药物合成方面，文库帮助构建高效合成药用化合物的菌株，推动生物制药的发展。然而，当前文库构建和应用仍面临诸如构建成本、基因组编辑的精确度及筛选效率等技术瓶颈。未来，自动化、数字化和新型筛选技术的进步有望突破这些瓶颈，推动酵母文库的快速构建和高效筛选，从而加速合成生物学在可持续发展和生态工程中的应用。

图2 SGA与PEM方法原理（本图由biorender绘制）
［（a）双突变体筛选策略。两种交配型的细胞分别在各自的突变位点携带不同抗性标签KanMX（绿色空心圆点）和NatMX（粉色空心圆点）用于筛选双突变体子代（黑线框细胞）；YFG （your favourite gene）：目的基因。（b）反二倍体筛选策略。含有野生型CAN1基因的单倍体细胞（蓝色细胞，a型）或二倍体细胞（紫色细胞）会摄入有毒的刀豆氨酸（canavanine），从而被杀死，而can1Δ突变体无法将刀豆氨酸运转入体内，因此能够存活（黑线框细胞）。（c）单倍体筛选策略。在某一细胞型的母本菌株中，构建另一细胞型特异性启动子与营养缺陷筛选标签的表达盒，用于选择任一性别的单倍体子代细胞。例如在a型细胞（蓝色）中，携带只能在α型细胞中表达的STE3pr-LEU2基因线路（红色实心圆点），只有细胞交配使STE3pr-LEU2基因线路存在于α型细胞中时，该细胞存活（含有红色实心圆点的红线框细胞）。（d）反二倍体与单倍体筛选共实现。通过将一个显性致死的抗性基因cyh^S（棕色实心方块）“镶嵌”在裂殖酵母交配位点mat1（在蓝色的h^-细胞中为蓝色方块表示的matP）附近，使得某一单倍体表型与抗性基因的表达偶联（matP-cyh^S）］

2001年，Tong等［23］开发了合成遗传阵列（synthetic genetic array，SGA）方法用于系统构建双基因修饰（敲除或过表达）文库，该方法利用自发的交配途径代替了冗长的转化过程。以构建酿酒酵母单倍双突变体为例（图2），在缺氮条件下诱导两种相反交配类型（MATa和MATα）的细胞交配，这些母本菌株包括以下3个特征：①它们分别在各自的突变位点携带不同抗性标签（KanMX和NatMX）用于筛选双突变体子代［图2（a）］。②在任一母本菌株中携带负筛选型突变（如can1Δ、lyp1Δ等），用于在选择性培养基上反筛选二倍体［图2（b）］。含有野生型CAN1基因的单倍体细胞或二倍体细胞会摄入有毒的刀豆氨酸（canavanine），从而被杀死，而can1Δ突变体无法将刀豆氨酸运转入体内，因此能够存活。③在某一细胞型的母本菌株中，构建另一细胞型特异性启动子与营养缺陷筛选标签的表达盒，用于选择任一性别的单倍体子代细胞［图2（c）］。如在MATa细胞中构建MATα特异型启动子STE2pr驱动his5基因的表达盒，只有当细胞发生交配产孢后，STE2pr-his5才能在MATα子代细胞中表达从而允许其在组氨酸缺陷型培养基上生长；同理，在MATα细胞中预先组装STE3pr-lue2表达盒，由于STE3pr只能在MATa细胞中表达，可以通过亮氨酸缺陷型培养基筛选MATa子代细胞。除了使用细胞型特异性启动子以外，Krogan课题组［24］还在裂殖酵母中开发了一种特定单倍体的偶联筛选策略PEM（pombe epistasis mapper），他们通过将一个显性致死的抗性基因（cyhS）“镶嵌”在交配位点mat1附近，使得某一单倍体表型与抗性基因的表达偶联，在添加环己胺（cycloheximide）的培养基上实现对这一单倍体的反筛［图2（d）］。根据双基因缺失菌株相对于任一单基因缺失菌株的生长情况，可以判断两个基因之间发生的负向或正向相互作用，揭示基因间的冗余或旁路抑制。