章益蜻, 刘高雯

合成生物学 2025, 6 (3): 685-700. DOI:10.12211/2096-8280.2024-079

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合成生物学作为一门通过设计、构建和改造生物系统来实现其特定功能的学科，被广泛应用于生物制造、环境保护和药物合成等领域。基因功能的系统性探索和工程菌株文库的构建是推动合成生物学发展的重要手段。本文重点介绍了不同酵母文库在合成生物学中的构建方法及其应用前景。随着基因组测序和高通量技术的快速进展，酿酒酵母和裂殖酵母等微生物文库在系统性研究中发挥了关键作用。基因缺失文库、过表达文库、转座子插入文库等多种类型的酵母文库为基因组合优化和代谢路径设计提供了重要工具，促进了代谢工程和合成生物学的创新应用。这些文库在工业生产中支持高产菌株的构建，如用于生物燃料和化学品的高效生产；在环境领域，通过基因改造筛选，生成具备污染物降解能力的菌株，为生态修复提供解决方案；在药物合成方面，文库帮助构建高效合成药用化合物的菌株，推动生物制药的发展。然而，当前文库构建和应用仍面临诸如构建成本、基因组编辑的精确度及筛选效率等技术瓶颈。未来，自动化、数字化和新型筛选技术的进步有望突破这些瓶颈，推动酵母文库的快速构建和高效筛选，从而加速合成生物学在可持续发展和生态工程中的应用。

图3 条件等位基因文库（本图由biorender绘制）
［（a）温度敏感型（temperature sensitive，TS）等位基因中，目的基因ORF（橘色片段）被替换成相应的温敏突变基因TS mutant（深橘色片段）并携带一个抗性筛选标签KanMX（黄色片段）。Chr.DNA：染色体DNA。（b）启动子替换策略中，携带抗性筛选标签KanMX（黄色片段）的诱导性启动子TetO（绿色片段）被插入目的基因ORF（橘色片段）的起始密码子上游。Chr.DNA：染色体DNA。（c）通过mRNA扰动降低蛋白丰度的DAmP策略中，目的基因ORF（橘色片段）的3′UTR区被插入一个抗性标签Kan^R（黄色片段）。Chr.DNA：染色体DNA］

（1）温度敏感型（temperature sensitive，TS）突变体［28］［图3（a）］。该等位基因表达的蛋白在正常或略低的培养温度下正常发挥功能，而在较高温度下因为蛋白折叠问题丧失功能。温度敏感突变等位基因的生成方式包括随机诱变［29-30］、基于蛋白质结构预测技术的理性设计与定向诱变［31-32］、在宿主蛋白内部插入温敏型内含肽［33］等。温度敏感突变体亦可携带分子条形码，便于高通量平行分析，通过“plasmid shuffle”［34］或“diploid shuffle”［30，35］将其整合到宿主中，广泛用于研究必需基因主导的生物过程，如细胞分裂和染色体稳定性［28，30］等。然而，这种方法的缺陷是温度的变化对细胞生理活动的普遍扰动，且已有的必需基因蛋白在温敏条件下仍然可能发挥作用，因此必需基因的功能研究仍不完全。

（2）诱导型启动子替换原生启动子［图3（b）］。例如，使用四环素诱导型启动子TetO7替换原启动子，实验表明，添加足以关闭该基因表达的强力霉素对整体基因表达几乎没有影响［36］。此外，Boone课题组［8］开发并鉴定了β-雌二醇诱导的YETI文库，每个基因的原生启动子被替换成一个工程化后的雌二醇诱导型启动子，每个基因在其原生位点上能够根据不同雌二醇浓度具有不同的表达水平。由于β-雌二醇不是酵母代谢物或信号分子，因此能够极大程度避免细胞代谢受到干扰。不同诱导物浓度与相应启动子的结合能够更加精准地调控基因表达水平，实现类似“变阻器”的效果，更好地研究基因剂量效应。

（3）通过mRNA扰动降低蛋白丰度［37-38］（decreased abundance by mRNA perturbation，DAmP）［图3（c）］。此策略通过在必需基因的3′UTR区插入一个抗生素耐药性标记物，降低目标mRNA的稳定性和丰度，使蛋白质水平在天然转录调控下降低，却足以支持菌株生存能力。对于必需基因来说，即便是基因的低水平表达也可以维持细胞的生存，但仍然能表现出一定的生长缺陷或特定的表型，从而揭示该基因的功能。