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CRISPR/Cas基因编辑及其新兴技术在丝状真菌研究中的系统应用
陈盈盈, 刘扬, 史俊杰, 马俊英, 鞠建华
合成生物学    2024, 5 (3): 672-693.   DOI:10.12211/2096-8280.2023-097
摘要   （736） HTML （80） PDF（pc） （2544KB）（555）  

丝状真菌（filamentous fungi）具有独特的形态和细胞构造，与人类健康和工农业生产息息相关，对这类生物资源的开发和利用高度依赖高效的基因编辑平台。然而，由于丝状真菌复杂多样的遗传背景，使用传统的基因编辑技术较难实现大范围的基因编辑，极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein）技术的出现，打破了这一困境，促进了不同种属和不同来源的丝状真菌的基因编辑，为丝状真菌的基础和应用研究带来了革命性的突破。本文简述了CRISPR/Cas系统的作用机理、分类及基于CRISPR的各种新型技术，归纳总结了丝状真菌中现有的CRISPR/Cas9系统功能组分、多种新兴CRISPR/Cas技术在丝状真菌中的应用现状以及海洋真菌中的CRISPR/Cas技术的应用情况。最后，对CRISPR/Cas系统在丝状真菌中应用进展缓慢、编辑效率低和脱靶效应等问题以及针对这些问题的潜在解决方法进行总结和展望，以期为不同类型的丝状真菌基因编辑平台的构建提供参考。


蛋白名称蛋白大小（AA）PAM/TAM序列gRNA大小剪切位点参考文献
SpCas91368NGG20 bp约3 bp 5′ of PAM[12]
FnCas91629NGG20 bp约3 bp 5′ of PAM[16]
SaCas91053NNGR RT21 bp约3 bp 5′ of PAM[17]
NmCas91082NNNNG ATT24 bp约3 bp 5′ of PAM[18]
St1Cas91121NNAGA AW20 bp约3 bp 5′ of PAM[13,19]
St3Cas91409NGGNG20 bp约3 bp 5′ of PAM[13,19]
CjCas9984NNNNACAC22 bp约3 bp 5′ of PAM[20]
CdCas91084NNRHHHY22 bp约3 bp 5′ of PAM[21]
GeoCas91087NNNNCRAA21/22 bp约3 bp 5′ of PAM[22]
AceCas91138NNNCC20 bp约3 bp 5′ of PAM[23]
AsCas12a1307TTTV24 bp约19/24 bp 3′ of PAM[24]
LbCas12a1228TTTV24 bp约19/24 bp 3′ of PAM[24]
FnCas12a1307TTV24 bp约19/24 bp 3′ of PAM[25]
Cas12b1108/1130TTN23 bp约17/23 bp 5′ of PAM[26-27]
Cas12f约400～6005′ T/C-rich20 bp/33～39 bp约3/24 bp 3′ of PAM[28-31]
CasX978TTCN20 bp约12/25 bp ′ of 3′ PAM[32]
TnpB/IscB/IsrB约400

TTGAT/ATAAA

/ATGA/NNG

15～45 bp

约3/12 bp of 5′ TAM

约6/21 bp of 3′ TAM

[33-34]
Fz约500～800

CATA/TTAAN

/CCG/TAG

7～21 bp约9/21 bp of 5′ TAM[35]
Cas14约400～700ssDNA20 bp[29]
Cas13约900～1250RNA targeting28 bp[36]
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表1 自然界中存在的关键Cas 类蛋白酶
正文中引用本图/表的段落
CRISPR/Cas系统主要可分为两大类（ClassⅠ和ClassⅡ），第一大类系统需要多个Cas蛋白形成复合体协同工作，包括TypeⅠ、Ⅲ和Ⅳ型，而第二大类系统仅需一个Cas蛋白就能够切割目标DNA，包括TypeⅡ、Ⅴ和Ⅵ类型［14］，这类系统较为简单，研究也更加透彻，是生物技术应用的首选。目前应用比较广泛的CRISPR/Cas，如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13等均为ClassⅡ系统。CRISPR/Cas9因具有简单、快捷等优势，已成为CRISPR/Cas系统中应用最为广泛的技术。来自化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9（SpCas9）系统是双RNA引导的——trans-activating crRNA（tracrRNA）靶向DNA，CRISPR associated RNA（crRNA）负责与Cas9形成复合物，并因其识别简单的NGG PAM序列，获得了广泛性应用。此外，研究者们仍一直积极地探索其他具有不同的蛋白分子量、PAM要求和底物偏好的CRISPR系统，仅Cas9的同源蛋白就有70多种已被详细评估过理化活性［15］。在过去的几年里，已经有超过20种不同的Cas同源蛋白被应用于基因编辑，为识别不同PAM序列提供了更多的靶点选择，其中一些典型性代表汇总于表1。
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］。由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子。常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］。已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用。
将催化失活的Cas蛋白与目标DNA的靶向结合形成空间位阻效应可导致基因表达的抑制，若将dCas9与转录阻遏因子融合则能实现高效的转录沉默，这个过程被称为CRISPR干扰（CRISPRi）［131-132］。CRISPRi系统既可结合于目标基因的启动子以阻止RNA聚合酶结合从而抑制转录起始，还可与开放阅读框靶向结合，抑制转录延伸［131，133］。目前，CRISPRi系统已应用于多种模式生物，然而在真菌微生物中，该基因干扰工具主要应用于酵母菌，在丝状真菌中的应用研究极少。2023年，华中农业大学谢卡斌团队［134］分别将dCas9与两个不同的转录阻遏结构域SRDX（SUPERMAN Repression domain）和Mxi1（repressor domain）融合，并测试了这两个体系在植物病原菌中的转录抑制效果。研究发现，在稻瘟病菌中CRISPR/dCas9-MxI1的抑制效果要高于CRISPR/dCas9-SRDX，且由MoRP27启动子驱动的dCas9-SRDX表达体系与MoTEF1启动子相比，可将抑制效率提高上百倍。此外，该研究还揭示gRNA结合于转录起始位点-100 bp到-200 bp之间可起到最佳的转录抑制效果，并利用tRNA-gRNA组装成多gRNA表达体系，在两株不同的植物病原菌中实现多基因高效抑制。相较于shRNA干扰和CRISPR介导的敲除，CRISPRi具有不损伤基因序列、特异性高、抑制效果强和实用性广等优势，在真菌基因功能研究尤其是必需关键基因的功能研究方面，具有巨大应用前景。
表观遗传修饰是指染色体DNA和组蛋白上的化学修饰，包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白磷酸化等，在不改变DNA序列的情况下，这些修饰可以通过改变染色质状态来控制基因的表达，并具有可遗传性。CRISPR表观遗传编辑是指将失去切割活性的Cas蛋白与表观遗传修饰因子融合来靶向改变目标区域的表观遗传修饰标记，从而影响基因的转录［135］。与传统的作用于全基因组的表观遗传调控手段相比，CRISPR表观遗传编辑因其可实现高效的靶向特异性表观遗传修饰，在生命科学研究中具有极大的应用前景。CRISPR表观遗传编辑系统的改造对象主要包括DNA的甲基化修饰和染色质上组蛋白的表观修饰。基于人源E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶（HAT）核心结构域与dCas9融合的基因激活系统，在人类细胞和多个物种表现出精准且高效的基因诱导活性［136-137］。2021年，研究人员首次将dCas9-p300表观编辑系统应用于丝状真菌中［138］。在黑曲霉中，dCas9-p300可诱导多个次级代谢产物合成基因的表达，并提高了伏马毒素B2的产量。此外，研究人员还将dCas9分别与黑曲霉内源性组蛋白乙酰化酶GcnE、组蛋白去乙酰化酶HosA和RpdA融合，构建了多个CRISPR表观遗传编辑系统。测试结果发现dCas9-GcnE/HosA/RpdA编辑体系均可抑制次级代谢产物合成基breF的表达，dCas9-HosA还可上调色素合成基因fwnA的表达［138］。这些研究结果表明丝状真菌中还存在其他因素可影响内源性表观遗传调控因子的调控效果，在推广应用丝状真菌来源的各种表观调控因子之前，还需更深入地研究这些表观调控因子的作用机制。
CRISPRoff/on是另外一个划时代的表观遗传调控系统，是由美国加州大学旧金山分校和麻省理工学院的研究团队联合开发［139］。CRISPRoff系统将转录抑制因子KRAB和DNA甲基转移酶D3A-D3L分别融合到dCas9的N末端/C末端，能够高特异性地持续沉默基因表达。为了逆转CRISPRoff系统介导的基因沉默，该团队还利用DNA去甲基化酶TET1与dCas9融合，并结合MS2-MCP转录激活系统，开发出一种可介导靶位点DNA去甲基化和基因转录激活的新工具CRISPRon系统，该系统可有效逆转人源细胞中由CRISPRoff介导的DNA甲基化修饰和转录抑制。近期，荷兰乌得勒支大学的研究人员首次将CRISPRoff/on应用于黑曲霉中［140］，CRISPRoff系统对黑曲霉中的flbA基因的抑制效率高达100%，即便在去除CRISPRoff编辑质粒之后，仍表现出可持续和可传代的抑制效果，且这些抑制效果可被导入的CRISPRon编辑质粒高效逆转。
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Application of CRISPR in filamentous fungi and macrofungi: from component function to development potentiality
5
2023
... CRISPR/Cas9系统介导的丝状真菌基因编辑技术始于2015年［40］，丝状真菌中的CRISPR/Cas9基因编辑系统由经密码子优化并添加核定位序列（NLS）的Cas9蛋白和gRNA组成.其中，gRNA是由crRNA和tracrRNA融合而成.Cas9可在gRNA引导下准确剪切目标基因，基因碱基的剪切可激发细胞内DNA的同源修复（HDR）或非同源末端连接 （NHEJ）修复，从而导致目标位点的删除、插入或替换.CRISPR/Cas9在丝状真菌中的应用过程，不仅继承了CRISPR系统在其他物种中的优势，还逐步建立了一系列适用于不同种属的丝状真菌的CRISPR系统［41］.选择合适的筛选标记、表达方法以及Cas9和gRNA的递送策略是成功进行基因编辑的关键，本章节将重点针对这些关键因素进行系统性的综述. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Development of the CRISPR/Cas9 system for targeted gene disruption in Aspergillus fumigatus
4
2015
... A. niger[42],A. fumigatus[43]等 ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Development of a genome-editing CRISPR/Cas9 system in thermophilic fungal Myceliophthora species and its application to hyper-cellulase production strain engineering
3
2017
... M. thermophila[48]等 ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Forced recycling of an AMA1-based genome-editing plasmid allows for efficient multiple gene deletion/integration in the industrial filamentous fungus Aspergillus oryzae
6
2019
... M. thermophila[48]等
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
5S rRNA promoter for guide RNA expression enabled highly efficient CRISPR/Cas9 genome editing in Aspergillus niger
5
2019
... A. niger[53], ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Development of versatile and efficient genetic tools for the marine-derived fungus Aspergillus terreus RA2905
3
2022
... M. thermophila[48]等
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Highly efficient single base editing in Aspergillus niger with CRISPR/Cas9 cytidine deaminase fusion
2
2019
... M. thermophila[48]等
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Development of a novel strategy for fungal transformation based on a mutant locus conferring carboxin-resistance in Magnaporthe oryzae
2
2016
... 抗性基因是发展最早、应用最广的一类筛选标记，具有应用方便、选择效率高、功能稳定等特点.抗性基因编码可使抗生素、除草剂等药物失活的酶（如潮霉素磷酸转移酶），从而使导入抗性基因的重组细胞可以在含有相应药物的培养基中生长.目前丝状真菌可使用的抗生素主要有：潮霉素（hygromycin）、遗传霉素（geneticin）、博来霉素（bleomycin）、吡啶硫胺素（pyrithiamine）、草铵膦（glufosinate）和萎锈灵（carboxin）等［41，63］.其中，潮霉素应用最为广泛，本课题组利用潮霉素抗性基因为筛选标记结合CRISPR/Cas9基因编辑系统系统，成功在两株不同种属的海洋真菌中实现基因敲除，激活了一系列沉默次级代谢物并解析了缩酚酸类化合物的生物合成［59，64］. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Applications of CRISPR/Cas9 in the synthesis of secondary metabolites in filamentous fungi
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2021
... 体内表达体系是将密码子优化过的Cas9蛋白表达序列置于真菌适用的启动子后面，并将组装好的DNA序列导入真菌细胞中在体内进行表达.启动子驱动表达能力的强弱是影响外源性Cas9蛋白表达效率的重要因素，因此选择合适的启动子对CRISPR/Cas9系统的功能发挥具有重要意义.用于Cas9表达的启动子为RNA聚合酶Ⅱ启动子，其主要分为组成型启动子和诱导型启动子.由于组成型启动子驱动基因表达不受空间和时间因素的影响，可在真菌细胞稳定持续表达，大多数研究中会优先选用其来驱动Cas9蛋白在丝状真菌中的表达.丝状真菌CRISPR/Cas9系统常用的组成型启动子主要是真菌来源的启动子序列，如tef1启动子、gpdA启动子和trpC启动子［55，60，81］，目前已应用CRISPR/Cas9的启动子具体信息在已有综述的基础上［41，82］总结更新于表3. ...
High-level expression of highly active and thermostable trehalase from Myceliophthora thermophila in Aspergillus niger by using the CRISPR/Cas9 tool and its application in ethanol fermentation
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2020
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Development of a versatile and conventional technique for gene disruption in filamentous fungi based on CRISPR-Cas9 technology
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2017
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Deletion of a rare fungal PKS CgPKS11 promotes chaetoglobosin A biosynthesis, yet defers the growth and development of Chaetomium globosum
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2021
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
The Ustilago hordei-barley interaction is a versatile system for characterization of fungal effectors
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2021
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Efficient genome editing using tRNA promoter-driven CRISPR/Cas9 gRNA in Aspergillus niger
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2018
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Genome editing in Shiraia bambusicola using CRISPR-Cas9 system
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2017
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Functional reconstitution of a fungal natural product gene cluster by advanced genome editing
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2017
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Penicillium oxalicum and Trichoderma reesei using 5S rRNA promoter-driven guide RNAs
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2021
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...

在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Identification and characterization of the determinants of copper resistance in the acidophilic fungus Acidomyces richmondensis MEY-1 using the CRISPR/Cas9 system
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2023
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
A versatile in vivo DNA assembly toolbox for fungal strain engineering
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2022
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Genome editing in Penicillium chrysogenum using Cas9 ribonucleoprotein particles
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2018
... Promoters for expressing Cas9/gRNA in filamentous fungi
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Production of L-malic acid by metabolically engineered Aspergillus nidulans based on efficient CRISPR-Cas9 and cre-loxP systems
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2023
... gRNA的高效表达也是CRISPR/Cas9系统发挥作用的关键因素.与Cas9的表达一致，gRNA的表达也分为体内和体外表达.gRNA的体外表达通常利用体外转录试剂盒由T7 RNA聚合酶转录而成［98］.gRNA的体外表达，尤其是在非模式真菌中，可以免去启动子的选择问题，但由于体外转录gRNA成本较高，且转化过程中容易降解，体内表达gRNA更受研究者的青睐.与Cas9蛋白体内表达不一样的是，驱动gRNA的启动子既可以是RNA聚合酶Ⅱ型启动子，也可以是Ⅲ型启动子.由于RNA聚合酶Ⅲ型启动子主要表达非编码短序列RNA，因此，在丝状真菌中用于体内表达 gRNA的启动子多为RNA聚合酶Ⅲ型启动子.目前常用的RNA聚合酶Ⅲ型启动子主要包括U6、5S rRNA、tRNA和SNR52启动子（表3）.不同类型的启动子的表达效率因菌株而异，如在烟曲霉中使用U6启动子建立的CRISPR/Cas9系统的基因编辑可达100%［60］，但在节孢霉属的编辑效率仅为16%［84］.与RNA聚合酶Ⅱ型启动子相比，在丝状真菌中，对RNA聚合酶Ⅲ型启动子作用机制的研究相对较少，且由于RNA聚合酶Ⅲ型启动子序列的低保守性使得难以在许多物种中鉴定RNA聚合酶Ⅲ型启动子，如果使用异源RNA聚合酶Ⅲ型启动子，通常会导致基因编辑低效.因此，选择合适的gRNA表达启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统开发中的技术关键. ...
CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用
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2022
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Research progress on application of CRISPR/Cas9 gene editing technique in filamentous fungi
1
2022
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Development of an efficient vector system for gene knock-out and near in-cis gene complementation in the sugarcane smut fungus
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2017
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Generation of Trichoderma harzianum with pyr4 auxotrophic marker by using the CRISPR/Cas9 system
1
2021
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
CRISPR-Cas9 induces point mutation in the mucormycosis fungus Rhizopus delemar
1
2019
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Methods for genetic transformation of filamentous fungi
1
2017
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Kinetic basis for DNA target specificity of CRISPR-Cas12a
1
2018
... Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］.在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］.Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］.基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术.类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因.Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］.基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］.此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4.CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行. ...
Multiplexed genome engineering by Cas12a and CRISPR arrays encoded on single transcripts
1
2019
... Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］.在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］.Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］.基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术.类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因.Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］.基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］.此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4.CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行. ...
Multiplex genome editing in Ashbya gossypii using CRISPR-Cpf1
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2020
... Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］.在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］.Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］.基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术.类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因.Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］.基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］.此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4.CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行. ...

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