陈盈盈, 刘扬, 史俊杰, 马俊英, 鞠建华

合成生物学 2024, 5 (3): 672-693. DOI:10.12211/2096-8280.2023-097

摘要（629）

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丝状真菌（filamentous fungi）具有独特的形态和细胞构造，与人类健康和工农业生产息息相关，对这类生物资源的开发和利用高度依赖高效的基因编辑平台。然而，由于丝状真菌复杂多样的遗传背景，使用传统的基因编辑技术较难实现大范围的基因编辑，极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein）技术的出现，打破了这一困境，促进了不同种属和不同来源的丝状真菌的基因编辑，为丝状真菌的基础和应用研究带来了革命性的突破。本文简述了CRISPR/Cas系统的作用机理、分类及基于CRISPR的各种新型技术，归纳总结了丝状真菌中现有的CRISPR/Cas9系统功能组分、多种新兴CRISPR/Cas技术在丝状真菌中的应用现状以及海洋真菌中的CRISPR/Cas技术的应用情况。最后，对CRISPR/Cas系统在丝状真菌中应用进展缓慢、编辑效率低和脱靶效应等问题以及针对这些问题的潜在解决方法进行总结和展望，以期为不同类型的丝状真菌基因编辑平台的构建提供参考。

分类

筛选标记

表征或筛选条件

应用

抗性基因标记

Hygromycin (hyg)

Hph (编码潮霉素磷酸转移酶), 具有潮霉素抗性

A. niger^[42],A. fumigatus^[43]等

本课题组各种海洋来源菌株

phosphinothricin (bar)

Bar (编码磷化麦黄酮乙酰转移酶),具有草胺膦抗性

Myceliophthora thermophila^[44],

Beauveria bassiana^[45]等

Carboxin (cbx)

点突变的SdhB (编码琥珀酸脱氢酶)可作为米曲霉的筛选标记,以醋酸盐作为碳源,可提高对萎锈灵的敏感性

A. oryzae^[46]等

Neomycin (neo)

Neo (编码氨基糖苷磷酸转移酶),具有G418 (新霉素衍生物)抗性

Phytophthora sojae^[47],

M. thermophila^[48]等

Pyrithiamine (ptrA)

点突变的PtrA (编码硫胺素噻唑合成酶基因),具有吡啶硫胺抗性

A. oryzae^[49],A. flavus^[50]等

Chlorimuron (sur)

Sur (乙酰乳酸合成酶)具有氯嘧磺隆抗性

Knufia petricola^[51]等

Fenhexamid (Fen^r)

点突变的 ERG27 (编码酮还原酶),具有环酰菌胺抗性

Botrytis cinerea^[52]等

Nourseothricin (Nat)

Nat (编码N-乙酰转移酶),具有诺尔斯菌素抗性

B. cinerea^[52]等

营养缺陷型标记

amdS

带有amdS基因的菌株在以乙酰胺为唯一氮源的培养基上能够正常生长

A. niger^[53],

M. thermophila^[48]等

niaD

niaD功能缺陷突变株能够耐受高浓度氯盐

A. oryzae^[49]等

pyrG

pyrG功能缺失的突变株只能在含有尿苷或尿嘧啶的培养基上正常生长

A. niger^[42], A. terreus^[54]等

argB

argB功能缺失的突变株只能在含有精氨酸的培养基上正常生长

A. nidulans^[55],A. oryzae^[56]等

adeA

adeA功能缺失的突变株只能在含有腺苷酸的培养基上正常生长

A. oryzae^[56]等

ppt1

缺失ppt1功能的突变体只能在添加赖氨酸的培养基上正常生长

F. fujikuroi^[57]等

表型报告基因

fcc1

fcc1基因的破坏可导致紫色色素的积累

F. fujikuroi^[57]等

wA突变体形成白色分生孢子

A. oryzae^[49],A. nidulans^[55]等

yA突变体形成黄色分生孢子

A. oryzae^[49], A.nidulans^[55]等

fwnA

fwnA突变体形成白色分生孢子

A. niger^[58]等

albA

albA突变体形成白色分生孢子

A. niger^[53]等

pkaC

pkaC (编码camp依赖性蛋白激酶的催化亚单位)的破坏可导致平板上的菌落直径大大减小

A. niger^[53]等

creA

creA 敲除菌株产孢能力显著降低

Spiromastix sp. ^[59]等

pksP

pksP敲除菌落具有明显的附白化表型

A. fumigatus^[60]等

cnaA

cnaA功能障碍导致菌丝生长缺陷显著,菌落表型非常小而密集

A. fumigatus^[60]等

ayg1

ayg1 敲除可导致孢子的颜色从黑色变为黄色

A. carbonarius^[61]等

cbh1

破坏cbh1将导致SDS-PAGE凝胶上的主要条带丢失,从而有利于通过成功的基因编辑鉴定菌株

Trichoderma reesei^[62]等

丝状真菌，尤其是各种特殊生境来源的野生真菌，选择性标记的缺乏是突变体筛选的主要障碍之一。常用的筛选标记包括：抗性标记、营养标记和表型报告标记。表型报告基因通常来源于特定物种中的独特表型，如一些色素合成基因、生长关键基因等，这些基因通常不具有通用性。综合现有的综述数据和研究论文［41］，现将丝状真菌中应用于CRISPR/Cas9的筛选标记总结于表2中。

表观遗传修饰是指染色体DNA和组蛋白上的化学修饰，包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白磷酸化等，在不改变DNA序列的情况下，这些修饰可以通过改变染色质状态来控制基因的表达，并具有可遗传性。CRISPR表观遗传编辑是指将失去切割活性的Cas蛋白与表观遗传修饰因子融合来靶向改变目标区域的表观遗传修饰标记，从而影响基因的转录［135］。与传统的作用于全基因组的表观遗传调控手段相比，CRISPR表观遗传编辑因其可实现高效的靶向特异性表观遗传修饰，在生命科学研究中具有极大的应用前景。CRISPR表观遗传编辑系统的改造对象主要包括DNA的甲基化修饰和染色质上组蛋白的表观修饰。基于人源E1A相关蛋白p300的组蛋白乙酰转移酶（HAT）核心结构域与dCas9融合的基因激活系统，在人类细胞和多个物种表现出精准且高效的基因诱导活性［136-137］。2021年，研究人员首次将dCas9-p300表观编辑系统应用于丝状真菌中［138］。在黑曲霉中，dCas9-p300可诱导多个次级代谢产物合成基因的表达，并提高了伏马毒素B₂的产量。此外，研究人员还将dCas9分别与黑曲霉内源性组蛋白乙酰化酶GcnE、组蛋白去乙酰化酶HosA和RpdA融合，构建了多个CRISPR表观遗传编辑系统。测试结果发现dCas9-GcnE/HosA/RpdA编辑体系均可抑制次级代谢产物合成基breF的表达，dCas9-HosA还可上调色素合成基因fwnA的表达［138］。这些研究结果表明丝状真菌中还存在其他因素可影响内源性表观遗传调控因子的调控效果，在推广应用丝状真菌来源的各种表观调控因子之前，还需更深入地研究这些表观调控因子的作用机制。