陈盈盈, 刘扬, 史俊杰, 马俊英, 鞠建华

合成生物学 2024, 5 (3): 672-693. DOI:10.12211/2096-8280.2023-097

摘要（629）

HTML （64）

PDF（pc）（2544KB）（480）

丝状真菌（filamentous fungi）具有独特的形态和细胞构造，与人类健康和工农业生产息息相关，对这类生物资源的开发和利用高度依赖高效的基因编辑平台。然而，由于丝状真菌复杂多样的遗传背景，使用传统的基因编辑技术较难实现大范围的基因编辑，极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein）技术的出现，打破了这一困境，促进了不同种属和不同来源的丝状真菌的基因编辑，为丝状真菌的基础和应用研究带来了革命性的突破。本文简述了CRISPR/Cas系统的作用机理、分类及基于CRISPR的各种新型技术，归纳总结了丝状真菌中现有的CRISPR/Cas9系统功能组分、多种新兴CRISPR/Cas技术在丝状真菌中的应用现状以及海洋真菌中的CRISPR/Cas技术的应用情况。最后，对CRISPR/Cas系统在丝状真菌中应用进展缓慢、编辑效率低和脱靶效应等问题以及针对这些问题的潜在解决方法进行总结和展望，以期为不同类型的丝状真菌基因编辑平台的构建提供参考。

Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系统的重要组成部分，具有切割目标靶点的作用。目前被广泛应用的CRISPR/Cas9系统来自于原核生物化脓性链球菌。由于不同的物种在编码蛋白质时具有密码子偏好性，当CRISPR/Cas9系统被用于丝状真菌的基因编辑时，需根据真菌密码子偏好性，重新设计优化Cas9基因序列。在丝状真菌中，常用的Cas9的氨基酸序列主要有人类密码子优化和真菌密码子优化来源（图2）。人源密码子优化的Cas9在烟曲霉（A. fumigatus）、大豆疫霉（P. sojae）、产黄青霉（Penicillium. chrysogenum）等菌株中都可以正常表达并发挥DNA剪切功能［43，47，73］。然而，人源密码子优化的Cas9在一些真菌中无法正常表达，研究者们因此根据不同真菌的密码子的偏好性，又合成了一系列不同真菌密码子优化的Cas9序列，包括里氏木霉（T. reesei）、黑曲霉（A. niger）、米曲霉（A. oryzae）、白僵菌（B. bassiana）等［40，45，55，74］。其中，根据里氏木霉和黑曲霉进行密码子优化的Cas9在其他真菌种属中有着较为广泛的应用，不同种属密码子优化的Cas9在丝状真菌中的应用情况已总结于图2。