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CRISPR/Cas基因编辑及其新兴技术在丝状真菌研究中的系统应用
陈盈盈, 刘扬, 史俊杰, 马俊英, 鞠建华
合成生物学    2024, 5 (3): 672-693.   DOI:10.12211/2096-8280.2023-097
摘要   （736） HTML （80） PDF（pc） （2544KB）（555）  

丝状真菌（filamentous fungi）具有独特的形态和细胞构造，与人类健康和工农业生产息息相关，对这类生物资源的开发和利用高度依赖高效的基因编辑平台。然而，由于丝状真菌复杂多样的遗传背景，使用传统的基因编辑技术较难实现大范围的基因编辑，极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein）技术的出现，打破了这一困境，促进了不同种属和不同来源的丝状真菌的基因编辑，为丝状真菌的基础和应用研究带来了革命性的突破。本文简述了CRISPR/Cas系统的作用机理、分类及基于CRISPR的各种新型技术，归纳总结了丝状真菌中现有的CRISPR/Cas9系统功能组分、多种新兴CRISPR/Cas技术在丝状真菌中的应用现状以及海洋真菌中的CRISPR/Cas技术的应用情况。最后，对CRISPR/Cas系统在丝状真菌中应用进展缓慢、编辑效率低和脱靶效应等问题以及针对这些问题的潜在解决方法进行总结和展望，以期为不同类型的丝状真菌基因编辑平台的构建提供参考。


菌株CRISPR/Cas12a 存在形式递送方式表达策略编辑效率参考 文献
嗜热毁丝霉 (M.thermophila)PCR产物PEG介导的 原生质体转化Ptef 启动子驱动Cas12a 的表达；U6启动子驱动gRNA的表达编辑单基因的效率为90%;编辑多个基因时，单基因发生编辑的效率为13%～41%;[44]

稻瘟病菌

(M. oryzae )

RNPPEG介导的 原生质体转化体外表达50%～100%的编辑效率[109-110]

棘孢曲霉

(A. aculeatus)

质粒PEG介导的 原生质体转化Ptef 启动子驱动Cas12a 的表达；U3启动子 驱动gRNA的表达接近100%的编辑效率[111]

阿舒氏囊霉

(A.gossypii)

质粒电转TSA1启动子驱动Cas12a的表达；SNR52启动子驱动gRNA的表达编辑效率根据靶序列有显著不同（19.2%～77.2%）[106]

构巢曲霉

(A. nidulans)

黑曲霉

(A. niger)

质粒PEG介导的 原生质体转化Ptef 启动子驱动Cas12a 的表达；U3启动子 驱动gRNA的表达80%～100%的编辑效率[112]

嗜热毁丝霉

(T.thermophilus)

RNP/质粒PEG介导的 原生质体转化Ptef 启动子驱动Cas12a 的表达；U6启动子驱动gRNA的表达单基因编辑效率可达100%，双基因编辑效率为40%～56%[113]

米曲霉

(A.oryzae)；

酱油曲霉

(A. sojae)

质粒PEG介导的 原生质体转化Ptef启动子驱动Cas12a的表达；PgpdA启动子驱动gRNA的表达在米曲霉中基因编辑效率为60%～100%，在酱油霉中基因编辑效率为50%～70%[114-115]
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表4 CRISPR/Cas12a 系统编辑丝状真菌的例子
正文中引用本图/表的段落
Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］。在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］。Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］。基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术。类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因。Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］。基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］。此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4。CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行。
胞嘧啶碱基编辑器是将nCas9（nickase Cas9）与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子融合，gRNA引导融合蛋白到靶位点时，暴露出来的非靶向DNA单链上的胞嘧啶C可被脱氨酶转换为尿嘧啶U，而U与胸腺嘧啶T的具有相同的碱基配对规则，在DNA修复时，尿嘧啶糖基化酶抑制子会抑制U→C的修复，提高U转换为T的修复效率，从而完成C→T的碱基转换［60-63］。2019年，华南理工大学潘力团队［58］首次将胞嘧啶碱基编辑器应用于黑曲霉中，其编辑效率可达47.36%～100%，且胞嘧啶碱基编辑器在黑曲霉中的靶向编辑窗口略大于其他物种。随后，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［123］又进一步在嗜热毁丝霉中构建了三个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器（Mtevo-BE4max、MtGAM-BE4max和Mtevo-CDA1）。测试结果显示，由海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶融合而成的胞嘧啶碱基编辑器（Mtevo-CDA1）在嗜热毁丝霉中编辑效率要高于另外两个由大鼠嘧啶脱氨酶融合而成的编辑器（Mtevo-BE4max和MtGAM-BE4max）。研究人员还利用Mtevo-CDA1深入研究了嗜热毁丝霉中转录调控因子Mtclr-2的功能，发现该蛋白的DNA结合结构域对培养基中纤维素的响应起关键作用，而真菌特异性结构域则与菌丝生长存在密切关系。该研究说明碱基编辑器可为研究丝状真菌中蛋白特殊结构域功能提供另一种高效的编辑工具。近期，美国莱斯大学的高雪团队［124］在丝状真菌中开发了基于胞嘧啶单碱基编辑器的多位点基因编辑系统，该体系利用CBE对功能基因中密码子CAG、CAA、CGA以及反义链中的CCA进行C→T的碱基转换，将终止密码子引入基因序列，致使基因失活，并结合tRNA-gRNA阵列表达体系，实现多个基因的同时失活。该研究利用CBE编辑系统对构巢曲霉中的表观遗传因子进行组合灭活，揭示了多种表观遗传调控因子在真菌次级代谢中的协同调控作用，还筛选到4种新型的天然产物。基于CBE的多位点基因编辑系统显著提高了丝状真菌基因组操作的能力，同时也为挖掘新型真菌活性天然产物提供了新的思路和策略。
在部分真菌中也可直接使用哺乳动物细胞中的表达系统，如在竹黄菌（S. bambusicola）中，研究者则直接利用人延长因子1α启动子来驱动Cas9蛋白的表达［13，89］.由于Cas9的持续表达会增加非特异性编辑的风险，同时对一些菌株还可能会产生细胞毒性，而可诱导型启动子能够在基因编辑期间调节CRISPR/Cas9系统的活力，并减少脱靶效应，所以在有特殊需求的情况下，研究者通常会选择可诱导型启动子.常用的可诱导型启动子包括淀粉诱导的启动子amyB、木聚糖诱导的启动子xylA、四环素诱导的启动子tetON等（表3）［73-74，92］.已有研究表明，构建不同丝状真菌的CRISPR/Cas9的基因编辑体系时，要根据菌株特性和实际情况选择最佳Cas9蛋白表达启动子，以保证CRISPR/Cas9系统能够在目标菌株中高效合理地发挥作用. ...
Production of L-malic acid by metabolically engineered Aspergillus nidulans based on efficient CRISPR-Cas9 and cre-loxP systems
1
2023
... gRNA的高效表达也是CRISPR/Cas9系统发挥作用的关键因素.与Cas9的表达一致，gRNA的表达也分为体内和体外表达.gRNA的体外表达通常利用体外转录试剂盒由T7 RNA聚合酶转录而成［98］.gRNA的体外表达，尤其是在非模式真菌中，可以免去启动子的选择问题，但由于体外转录gRNA成本较高，且转化过程中容易降解，体内表达gRNA更受研究者的青睐.与Cas9蛋白体内表达不一样的是，驱动gRNA的启动子既可以是RNA聚合酶Ⅱ型启动子，也可以是Ⅲ型启动子.由于RNA聚合酶Ⅲ型启动子主要表达非编码短序列RNA，因此，在丝状真菌中用于体内表达 gRNA的启动子多为RNA聚合酶Ⅲ型启动子.目前常用的RNA聚合酶Ⅲ型启动子主要包括U6、5S rRNA、tRNA和SNR52启动子（表3）.不同类型的启动子的表达效率因菌株而异，如在烟曲霉中使用U6启动子建立的CRISPR/Cas9系统的基因编辑可达100%［60］，但在节孢霉属的编辑效率仅为16%［84］.与RNA聚合酶Ⅱ型启动子相比，在丝状真菌中，对RNA聚合酶Ⅲ型启动子作用机制的研究相对较少，且由于RNA聚合酶Ⅲ型启动子序列的低保守性使得难以在许多物种中鉴定RNA聚合酶Ⅲ型启动子，如果使用异源RNA聚合酶Ⅲ型启动子，通常会导致基因编辑低效.因此，选择合适的gRNA表达启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统开发中的技术关键. ...
CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用
1
2022
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Research progress on application of CRISPR/Cas9 gene editing technique in filamentous fungi
1
2022
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Development of an efficient vector system for gene knock-out and near in-cis gene complementation in the sugarcane smut fungus
1
2017
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Generation of Trichoderma harzianum with pyr4 auxotrophic marker by using the CRISPR/Cas9 system
1
2021
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
CRISPR-Cas9 induces point mutation in the mucormycosis fungus Rhizopus delemar
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2019
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Methods for genetic transformation of filamentous fungi
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2017
... 将外源组装的Cas9蛋白与gRNA表达质粒（DNA）、体外转录的gRNA（RNA）或RNP蛋白导入真菌细胞中是CRISPR/Cas9系统高效编辑的另一关键步骤.CRISPR/Cas9系统转化到真菌细胞中的方法有聚乙二醇介导的转化（PMT）、农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）介导的转化（AMT）、电穿孔转化和基因枪转化法［41，99］，其中，PMT和AMT转化法在丝状真菌中应用相对较广.PMT 是将原生质体与外源DNA在含有CaCl2的聚乙二醇缓冲液中混合，待宿主细胞膜通透性发生变化后，外源DNA进入宿主细胞，通过原生质体再生和转化子筛选获得重组菌株.PMT介导的CRISPR/Cas9递送系统已成功应用于一系列真菌，包括米曲霉（A. oryzae）、黑曲霉（A. niger）和烟曲霉（A. fumigatus）等［43，49，55］.PMT转化法对菌株的生长阶段、细胞壁消化酶的选择都有较高的要求，部分真菌因此较难获得高质量原生质体，从而影响基因编辑效率.由于农杆菌介导的转化可直接作用于孢子和各种生长状态的菌丝体，可避免原生质制备困难等阻碍，已成为CRISPR/Cas9递送的另一选择.根癌农杆菌可以感染任何高等生物，并通过vir基因产物的活性将DNA片段从肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主基因组中.转化后，通过使用头孢噻肟作为选择压力，可将根癌农杆菌从培养物中除去.利用这一特性，AMT已被应用于各种真菌的转化，目前，农杆菌介导CRISPR/Cas9递送系统的在植物病原菌中应用较多，包括：甘蔗黑穗病真菌（Sporisorium scitamineum）、稻瘟病菌（M. oryzae）、炭黑曲霉（A. carbonarius）等［61，71，100］.虽然根癌农杆菌已成功介导多种真菌的转化，但该方法操作过程非常烦琐，且根癌农杆菌株和双元载体的选择等因素都可影响农杆菌介导真菌转化的效率.Weyda等［61］曾在炭黑曲霉（A. carbonarius）中系统地比较了PMT和AMT对CRISPR/Cas9转导的影响，该研究发现这两种方法都可以有效介导CRISPR/Cas9的基因编辑，两种方法均存在各自的优缺点，具体选用哪种方法要结合菌株特性、操作难易程度和试剂价格等综合考虑.此外，基因枪转化法［101］、电穿孔转化法［102］等也被应用到丝状真菌CRISPR/Cas9系统的遗传转化中，但由于基因枪转化法价格昂贵，电穿孔转化法变量较多且容易对细胞造成伤害等，这两种方法在丝状真菌中的普及程度远不如PMT和AMT ［103］. ...
Kinetic basis for DNA target specificity of CRISPR-Cas12a
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2018
... Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］.在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］.Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］.基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术.类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因.Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］.基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］.此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4.CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行. ...
Multiplexed genome engineering by Cas12a and CRISPR arrays encoded on single transcripts
1
2019
... Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］.在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］.Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］.基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术.类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因.Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］.基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］.此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4.CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行. ...
Multiplex genome editing in Ashbya gossypii using CRISPR-Cpf1
2
2020
... Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］.在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］.Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］.基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术.类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因.Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］.基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］.此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4.CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行. ...

构巢曲霉 ...
CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection
1
2018
... Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］.在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］.Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］.基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术.类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因.Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］.基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］.此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4.CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行. ...
CRISPR-Cas12a-based diagnostics of wheat fungal diseases
1
2022
... Cas12a核酸内切酶功能由张锋实验室在2015年首次鉴定［25］，Cas12a的识别序列（5′-TTTV-3′）和切割方式（切割DNA双链产生黏性末端）与Cas9有较大的差异，因此，CRISPR/Cas12a作为进阶版基因编辑工具可扩充CRISPR/Cas系统及其衍生技术体系的基因编辑范围［38］.在编辑效率方面，Cas12a的编辑效率要低于Cas9，但Cas12a具有更低的容错率和更高的特异性［104］.Cas12a比较重要的一个特点是其只需单一RNA引导，且Cas12a自带的RNA酶结构域可处理preCrRNAs产生成熟CrRNAs，利用该特性，Cas12a系统则可以在一个质粒上仅用一个启动子串联多个CrRNA，由Cas12a剪切合成多个单独的成熟CrRNA，为多基因编辑提供便利［105］.基于CRISPR/Cas12a的多基因编辑系统，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［44］在嗜热毁丝菌（M. thermophila）成功实现高效的多基因编辑，并进一步开发了CRISPR/Cas12辅助的标记回收技术.类似地，Jimenez等［106］利用CRISPR/Cas12a多基因编辑系统在阿舒氏囊霉（A. gossypii）中敲除了5个营养缺陷标记基因.Cas12a还具有PAM特异性识别和对单链DNA的非特异性切割的独特属性，在DNA诊断方面拥有巨大潜力［107］.基于此，研究人员将PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a相结合开发了一种检测系统，可用于监测小麦中禾谷镰刀菌（F. graminearum）侵染情况［108］.此外，研究者们还在构巢曲霉（A. nidulans）、棘孢曲霉（A. aculeatus）等丝状真菌中建立了基于CRISPR/Cas12a的基因编辑工具，具体信息详见表4.CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9基因编辑技术相互补充，研究者可根据实际需求选择最适合的编辑工具，保障丝状真菌的基因编辑工作高效进行. ...
CRISPR-Cas12a induced DNA double-strand breaks are repaired by multiple pathways with different mutation profiles in Magnaporthe oryzae
1
2022
... (M. oryzae )
碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上，将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合，实现不同碱基的转换，最初是由David Liu团队在2016年 开发［116-118］.武汉大学孙宇辉团队［119］已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍，在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前，丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入（knock-in）并替换完成［69，120］.虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换，但其效率较低.与之相比，单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率，在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景［121］.迄今为止，研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器，其中使用较为广泛的主要有两种类型：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE），分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变［122］.目前，碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少，且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage
1
2016
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上，将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合，实现不同碱基的转换，最初是由David Liu团队在2016年 开发［116-118］.武汉大学孙宇辉团队［119］已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍，在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前，丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入（knock-in）并替换完成［69，120］.虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换，但其效率较低.与之相比，单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率，在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景［121］.迄今为止，研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器，其中使用较为广泛的主要有两种类型：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE），分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变［122］.目前，碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少，且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Base editing: advances and therapeutic opportunities
0
2020
Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C: G-to-T: a base editors with higher efficiency and product purity
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2017
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上，将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合，实现不同碱基的转换，最初是由David Liu团队在2016年 开发［116-118］.武汉大学孙宇辉团队［119］已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍，在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前，丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入（knock-in）并替换完成［69，120］.虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换，但其效率较低.与之相比，单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率，在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景［121］.迄今为止，研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器，其中使用较为广泛的主要有两种类型：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE），分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变［122］.目前，碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少，且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
碱基编辑技术及其在微生物合成生物学中的应用
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2023
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上，将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合，实现不同碱基的转换，最初是由David Liu团队在2016年 开发［116-118］.武汉大学孙宇辉团队［119］已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍，在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前，丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入（knock-in）并替换完成［69，120］.虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换，但其效率较低.与之相比，单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率，在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景［121］.迄今为止，研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器，其中使用较为广泛的主要有两种类型：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE），分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变［122］.目前，碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少，且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Base editing technology and its application in microbial synthetic biology
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2023
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上，将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合，实现不同碱基的转换，最初是由David Liu团队在2016年 开发［116-118］.武汉大学孙宇辉团队［119］已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍，在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前，丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入（knock-in）并替换完成［69，120］.虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换，但其效率较低.与之相比，单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率，在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景［121］.迄今为止，研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器，其中使用较为广泛的主要有两种类型：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE），分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变［122］.目前，碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少，且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
CRISPR/Cas9 genome editing to demonstrate the contribution of Cyp51A Gly138Ser to azole resistance in Aspergillus fumigatus
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2018
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上，将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合，实现不同碱基的转换，最初是由David Liu团队在2016年 开发［116-118］.武汉大学孙宇辉团队［119］已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍，在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前，丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入（knock-in）并替换完成［69，120］.虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换，但其效率较低.与之相比，单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率，在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景［121］.迄今为止，研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器，其中使用较为广泛的主要有两种类型：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE），分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变［122］.目前，碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少，且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases
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2017
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上，将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合，实现不同碱基的转换，最初是由David Liu团队在2016年 开发［116-118］.武汉大学孙宇辉团队［119］已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍，在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前，丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入（knock-in）并替换完成［69，120］.虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换，但其效率较低.与之相比，单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率，在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景［121］.迄今为止，研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器，其中使用较为广泛的主要有两种类型：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE），分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变［122］.目前，碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少，且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
CRISPR-Cas9 base editors and their current role in human therapeutics
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2023
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上，将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合，实现不同碱基的转换，最初是由David Liu团队在2016年 开发［116-118］.武汉大学孙宇辉团队［119］已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍，在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前，丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入（knock-in）并替换完成［69，120］.虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换，但其效率较低.与之相比，单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率，在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景［121］.迄今为止，研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器，其中使用较为广泛的主要有两种类型：腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE），分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变［122］.目前，碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少，且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Development of an efficient C-to-T base-editing system and its application to cellulase transcription factor precise engineering in thermophilic fungus Myceliophthora thermophila
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2022
... 胞嘧啶碱基编辑器是将nCas9（nickase Cas9）与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子融合，gRNA引导融合蛋白到靶位点时，暴露出来的非靶向DNA单链上的胞嘧啶C可被脱氨酶转换为尿嘧啶U，而U与胸腺嘧啶T的具有相同的碱基配对规则，在DNA修复时，尿嘧啶糖基化酶抑制子会抑制U→C的修复，提高U转换为T的修复效率，从而完成C→T的碱基转换［60-63］.2019年，华南理工大学潘力团队［58］首次将胞嘧啶碱基编辑器应用于黑曲霉中，其编辑效率可达47.36%～100%，且胞嘧啶碱基编辑器在黑曲霉中的靶向编辑窗口略大于其他物种.随后，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［123］又进一步在嗜热毁丝霉中构建了三个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器（Mtevo-BE4max、MtGAM-BE4max和Mtevo-CDA1）.测试结果显示，由海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶融合而成的胞嘧啶碱基编辑器（Mtevo-CDA1）在嗜热毁丝霉中编辑效率要高于另外两个由大鼠嘧啶脱氨酶融合而成的编辑器（Mtevo-BE4max和MtGAM-BE4max）.研究人员还利用Mtevo-CDA1深入研究了嗜热毁丝霉中转录调控因子Mtclr-2的功能，发现该蛋白的DNA结合结构域对培养基中纤维素的响应起关键作用，而真菌特异性结构域则与菌丝生长存在密切关系.该研究说明碱基编辑器可为研究丝状真菌中蛋白特殊结构域功能提供另一种高效的编辑工具.近期，美国莱斯大学的高雪团队［124］在丝状真菌中开发了基于胞嘧啶单碱基编辑器的多位点基因编辑系统，该体系利用CBE对功能基因中密码子CAG、CAA、CGA以及反义链中的CCA进行C→T的碱基转换，将终止密码子引入基因序列，致使基因失活，并结合tRNA-gRNA阵列表达体系，实现多个基因的同时失活.该研究利用CBE编辑系统对构巢曲霉中的表观遗传因子进行组合灭活，揭示了多种表观遗传调控因子在真菌次级代谢中的协同调控作用，还筛选到4种新型的天然产物.基于CBE的多位点基因编辑系统显著提高了丝状真菌基因组操作的能力，同时也为挖掘新型真菌活性天然产物提供了新的思路和策略. ...
Multiplex base-editing enables combinatorial epigenetic regulation for genome mining of fungal natural products
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2023
... 胞嘧啶碱基编辑器是将nCas9（nickase Cas9）与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子融合，gRNA引导融合蛋白到靶位点时，暴露出来的非靶向DNA单链上的胞嘧啶C可被脱氨酶转换为尿嘧啶U，而U与胸腺嘧啶T的具有相同的碱基配对规则，在DNA修复时，尿嘧啶糖基化酶抑制子会抑制U→C的修复，提高U转换为T的修复效率，从而完成C→T的碱基转换［60-63］.2019年，华南理工大学潘力团队［58］首次将胞嘧啶碱基编辑器应用于黑曲霉中，其编辑效率可达47.36%～100%，且胞嘧啶碱基编辑器在黑曲霉中的靶向编辑窗口略大于其他物种.随后，中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队［123］又进一步在嗜热毁丝霉中构建了三个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器（Mtevo-BE4max、MtGAM-BE4max和Mtevo-CDA1）.测试结果显示，由海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶融合而成的胞嘧啶碱基编辑器（Mtevo-CDA1）在嗜热毁丝霉中编辑效率要高于另外两个由大鼠嘧啶脱氨酶融合而成的编辑器（Mtevo-BE4max和MtGAM-BE4max）.研究人员还利用Mtevo-CDA1深入研究了嗜热毁丝霉中转录调控因子Mtclr-2的功能，发现该蛋白的DNA结合结构域对培养基中纤维素的响应起关键作用，而真菌特异性结构域则与菌丝生长存在密切关系.该研究说明碱基编辑器可为研究丝状真菌中蛋白特殊结构域功能提供另一种高效的编辑工具.近期，美国莱斯大学的高雪团队［124］在丝状真菌中开发了基于胞嘧啶单碱基编辑器的多位点基因编辑系统，该体系利用CBE对功能基因中密码子CAG、CAA、CGA以及反义链中的CCA进行C→T的碱基转换，将终止密码子引入基因序列，致使基因失活，并结合tRNA-gRNA阵列表达体系，实现多个基因的同时失活.该研究利用CBE编辑系统对构巢曲霉中的表观遗传因子进行组合灭活，揭示了多种表观遗传调控因子在真菌次级代谢中的协同调控作用，还筛选到4种新型的天然产物.基于CBE的多位点基因编辑系统显著提高了丝状真菌基因组操作的能力，同时也为挖掘新型真菌活性天然产物提供了新的思路和策略. ...
CRISPR technology: a decade of genome editing is only the beginning
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2023
... CRISPR/Cas除了可用上述的基因编辑功能来灭活各种调控因子或替换启动子进而影响基因的表达，还可将丧失切割活性但仍具有RNA引导下与DNA结合能力的Cas蛋白突变体（dCas9/12）与各种效应因子融合来实现位点特异性基因调控［125］.由dCas介导的转录调控不会引起双链或单链的断裂，从而避免对宿主细胞的伤害，在转录调控方面具有巨大的应用前景.目前，已与dCas9/12融合并应用于丝状真菌的调控因子主要包括转录激活因子、抑制因子和表观遗传修饰因子（图3），具体信息综述如下. ...
Modular synthetic biology toolkit for filamentous fungi
1
2021
... CRISPR介导的转录激活（CRISPRa）主要是通过将核酸内切酶失活的dCas9/12与转录激活因子融合，并在gRNA指导下结合到目标基因的启动子区域，从而增强特定基因的表达［126］.目前已有多种不同CRISPRa系统被开发出来，这些系统不仅包括转录激活效应子，如VP16、TV（VP128-TALE）、VPR（VP64-p65-Rta）、SunTag（通过抗体募集各种激活因子）等与dCas9融合的系统［127-129］，还包括以gRNA为支架的转录激活效应子招募系统［129］.虽然各种CRISPRa系统不断被开发出来并表现出良好的调控效果，但是在丝状真菌中的相关研究报道较少，且只有VPR系统有相关应用.VPR系统包含3个转录激活因子：VP64、p65和Rta.其中，VP64是单纯疱疹蛋白16的TAD四聚体，p65是核因子NF-κB蛋白质家族中的成员，Rta（replication and transcription activator，Rta）则是由Y疱疹病毒所编码的转录激活蛋白.将这三种激活因子融合构成的激活元件VP64-p65-Rta（VPR）可显著提高内源性靶标激活水平［127］.2020年，Roux等［130］在构巢曲霉中构建了首个CRISPRa系统，该研究将VPR激活元件分别与dCas9和dCas12融合构成CRISPR/dSpCas9-VPR和CRISPR/dLbCas12a-VPR，并分别测试了这两种系统在构巢曲霉中的激活效率.结果表明，dCas12a体系比dCas9具有更好的多基因激活效果，并且通过使用CRISPR/dLbCas12a-VPR激活非核糖体肽合成酶micA基因，提高了微呋喃酮的产量［130］.在鲁本斯青霉（P. rubens）中，研究人员则利用CRISPR/dSpCas9-VPR系统，将dSpCas9-VPR结合到转录调控因子macR的启动子上，进而激活沉默基因簇的表达，诱导产生macrophorin类次级代谢物［90］.上述研究表明CRISPRa工具在激活真菌沉默基因簇中发挥重要作用，进一步拓展各种CRISPRa激活工具在丝状真菌中的应用将为高值次级代谢产物的挖掘奠定重要基础. ...
Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming
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2015
... CRISPR介导的转录激活（CRISPRa）主要是通过将核酸内切酶失活的dCas9/12与转录激活因子融合，并在gRNA指导下结合到目标基因的启动子区域，从而增强特定基因的表达［126］.目前已有多种不同CRISPRa系统被开发出来，这些系统不仅包括转录激活效应子，如VP16、TV（VP128-TALE）、VPR（VP64-p65-Rta）、SunTag（通过抗体募集各种激活因子）等与dCas9融合的系统［127-129］，还包括以gRNA为支架的转录激活效应子招募系统［129］.虽然各种CRISPRa系统不断被开发出来并表现出良好的调控效果，但是在丝状真菌中的相关研究报道较少，且只有VPR系统有相关应用.VPR系统包含3个转录激活因子：VP64、p65和Rta.其中，VP64是单纯疱疹蛋白16的TAD四聚体，p65是核因子NF-κB蛋白质家族中的成员，Rta（replication and transcription activator，Rta）则是由Y疱疹病毒所编码的转录激活蛋白.将这三种激活因子融合构成的激活元件VP64-p65-Rta（VPR）可显著提高内源性靶标激活水平［127］.2020年，Roux等［130］在构巢曲霉中构建了首个CRISPRa系统，该研究将VPR激活元件分别与dCas9和dCas12融合构成CRISPR/dSpCas9-VPR和CRISPR/dLbCas12a-VPR，并分别测试了这两种系统在构巢曲霉中的激活效率.结果表明，dCas12a体系比dCas9具有更好的多基因激活效果，并且通过使用CRISPR/dLbCas12a-VPR激活非核糖体肽合成酶micA基因，提高了微呋喃酮的产量［130］.在鲁本斯青霉（P. rubens）中，研究人员则利用CRISPR/dSpCas9-VPR系统，将dSpCas9-VPR结合到转录调控因子macR的启动子上，进而激活沉默基因簇的表达，诱导产生macrophorin类次级代谢物［90］.上述研究表明CRISPRa工具在激活真菌沉默基因簇中发挥重要作用，进一步拓展各种CRISPRa激活工具在丝状真菌中的应用将为高值次级代谢产物的挖掘奠定重要基础. ...

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