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蛋白质工程在医药产业中的应用
温艳华, 刘合栋, 曹春来, 巫瑞波
合成生物学    2025, 6 (1): 65-86.   DOI:10.12211/2096-8280.2024-061
摘要   （929） HTML （103） PDF（pc） （2141KB）（793）  

蛋白质工程，通过定向进化、半理性或理性设计、计算机辅助设计等手段，实现对蛋白质特定功能的设计和改造，获得的工程化蛋白质在食品、医药、能源、材料等行业具有重要的应用价值。在医药化工领域，工程化酶可作为化学原料药及其中间体合成的高效生物催化剂，实现医药工业绿色制造。在生物制药领域，多肽或蛋白修饰酶的改造可显著提升候选药物的制备效率，诊断酶的改造则可以大幅增强检测的准确性和灵敏度。此外，蛋白质工程在提升治疗性酶和治疗性抗体等生物制剂的生物活性、增强药物稳定性、降低免疫原性等方面也发挥重要作用，从而提高药物的可开发性、安全性和有效性。因此，本文简要回顾了蛋白质工程的发展历程，具体阐述了其在化学原料药合成和生物制药两大产业中的一系列应用实例，旨在剖析蛋白质工程在科技成果转化及医药产业应用中存在的问题与挑战，并展望医药产业中蛋白质工程的未来发展方向，以期为促进产学研一体化发展提供借鉴。



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图3 二步三酶法制备阿托伐他汀的中间体羟基腈
正文中引用本图/表的段落
辉瑞的Lipitor?是世界上第一个年销售额超过100亿美元的药物，其活性成分为阿托伐他汀（atorvastatin）［75］。据估计，阿托伐他汀的中间体羟基腈（hydroxynitrile，HN）的年需求量接近20万千克。传统的商业化HN工艺需要动力学拆分（最大收率50%）并且涉及溴化学或不对称氢化的手性池前体合成［76］。由于副产物多，需要高真空分馏来纯化最终产品，导致产量更低。使用腈酶、脂肪酶等的化学酶法合成并未商业化，这类工艺需要用的酶量较多使得产物难以分离，也增加了成本［75］。因此，Codexis开发了二步三酶法制备HN［76］（图3），第一步使用KRED（EC 1.1.1.184）将羰基立体选择性地还原为羟基，并组合NADP依赖的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC 1.1.1.47）用于辅因子再生；第二步使用卤代醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase，HHDH，EC 3.8.1.5）将氯取代为氰基［77-78］。由于这三个酶均不能满足大规模制备HN的需求，因此研究团队使用DNA shuffling构建突变库，在接近生产工艺的条件下进行高通量筛选，催化性质提高的突变体被用于下一轮进化，最终提高了所用KRED和GDH的活性和稳定性，同时保持了天然KRED近乎完美的对映选择性，提高了HHDH的活性并在很大程度上解除了底物抑制。新的生产工艺满足绿色化学的12项原则。不包含工艺用水时，整个工艺的E因子（每千克产物对应废弃物的质量）为5.8，如果包含工艺用水，E因子为18。在生物催化剂的基础上，这三种酶将还原反应的体积生产率（volumetric productivity，VP）［79］提高了约100倍，将氰化反应的VP提高了约4000倍。这极大地改善了Lipitor?的关键中间体的生产，Codexis公司因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2006年更绿色反应条件奖”［80］。
活性↑，稳定性↑ ...
Application of ketoreductase in asymmetric synthesis of pharmaceuticals and bioactive molecules: an update (2018—2020)
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2021
... 酮还原酶（ketoreductase，KRED）可以催化链状酮、环酮、脂肪酮和芳香酮等的不对称还原，引入1～2个手性中心［74］，因此在医药工业的手性醇合成中应用广泛. ...
Biocatalytic synthesis of atorvastatin intermediates
2
2009
... 辉瑞的Lipitor?是世界上第一个年销售额超过100亿美元的药物，其活性成分为阿托伐他汀（atorvastatin）［75］.据估计，阿托伐他汀的中间体羟基腈（hydroxynitrile，HN）的年需求量接近20万千克.传统的商业化HN工艺需要动力学拆分（最大收率50%）并且涉及溴化学或不对称氢化的手性池前体合成［76］.由于副产物多，需要高真空分馏来纯化最终产品，导致产量更低.使用腈酶、脂肪酶等的化学酶法合成并未商业化，这类工艺需要用的酶量较多使得产物难以分离，也增加了成本［75］.因此，Codexis开发了二步三酶法制备HN［76］（图3），第一步使用KRED（EC 1.1.1.184）将羰基立体选择性地还原为羟基，并组合NADP依赖的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC 1.1.1.47）用于辅因子再生；第二步使用卤代醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase，HHDH，EC 3.8.1.5）将氯取代为氰基［77-78］.由于这三个酶均不能满足大规模制备HN的需求，因此研究团队使用DNA shuffling构建突变库，在接近生产工艺的条件下进行高通量筛选，催化性质提高的突变体被用于下一轮进化，最终提高了所用KRED和GDH的活性和稳定性，同时保持了天然KRED近乎完美的对映选择性，提高了HHDH的活性并在很大程度上解除了底物抑制.新的生产工艺满足绿色化学的12项原则.不包含工艺用水时，整个工艺的E因子（每千克产物对应废弃物的质量）为5.8，如果包含工艺用水，E因子为18.在生物催化剂的基础上，这三种酶将还原反应的体积生产率（volumetric productivity，VP）［79］提高了约100倍，将氰化反应的VP提高了约4000倍.这极大地改善了Lipitor?的关键中间体的生产，Codexis公司因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2006年更绿色反应条件奖”［80］. ...

Bacillus subtilis ...
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... 辉瑞的Lipitor?是世界上第一个年销售额超过100亿美元的药物，其活性成分为阿托伐他汀（atorvastatin）［75］.据估计，阿托伐他汀的中间体羟基腈（hydroxynitrile，HN）的年需求量接近20万千克.传统的商业化HN工艺需要动力学拆分（最大收率50%）并且涉及溴化学或不对称氢化的手性池前体合成［76］.由于副产物多，需要高真空分馏来纯化最终产品，导致产量更低.使用腈酶、脂肪酶等的化学酶法合成并未商业化，这类工艺需要用的酶量较多使得产物难以分离，也增加了成本［75］.因此，Codexis开发了二步三酶法制备HN［76］（图3），第一步使用KRED（EC 1.1.1.184）将羰基立体选择性地还原为羟基，并组合NADP依赖的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC 1.1.1.47）用于辅因子再生；第二步使用卤代醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase，HHDH，EC 3.8.1.5）将氯取代为氰基［77-78］.由于这三个酶均不能满足大规模制备HN的需求，因此研究团队使用DNA shuffling构建突变库，在接近生产工艺的条件下进行高通量筛选，催化性质提高的突变体被用于下一轮进化，最终提高了所用KRED和GDH的活性和稳定性，同时保持了天然KRED近乎完美的对映选择性，提高了HHDH的活性并在很大程度上解除了底物抑制.新的生产工艺满足绿色化学的12项原则.不包含工艺用水时，整个工艺的E因子（每千克产物对应废弃物的质量）为5.8，如果包含工艺用水，E因子为18.在生物催化剂的基础上，这三种酶将还原反应的体积生产率（volumetric productivity，VP）［79］提高了约100倍，将氰化反应的VP提高了约4000倍.这极大地改善了Lipitor?的关键中间体的生产，Codexis公司因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2006年更绿色反应条件奖”［80］. ...
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... 辉瑞的Lipitor?是世界上第一个年销售额超过100亿美元的药物，其活性成分为阿托伐他汀（atorvastatin）［75］.据估计，阿托伐他汀的中间体羟基腈（hydroxynitrile，HN）的年需求量接近20万千克.传统的商业化HN工艺需要动力学拆分（最大收率50%）并且涉及溴化学或不对称氢化的手性池前体合成［76］.由于副产物多，需要高真空分馏来纯化最终产品，导致产量更低.使用腈酶、脂肪酶等的化学酶法合成并未商业化，这类工艺需要用的酶量较多使得产物难以分离，也增加了成本［75］.因此，Codexis开发了二步三酶法制备HN［76］（图3），第一步使用KRED（EC 1.1.1.184）将羰基立体选择性地还原为羟基，并组合NADP依赖的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC 1.1.1.47）用于辅因子再生；第二步使用卤代醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase，HHDH，EC 3.8.1.5）将氯取代为氰基［77-78］.由于这三个酶均不能满足大规模制备HN的需求，因此研究团队使用DNA shuffling构建突变库，在接近生产工艺的条件下进行高通量筛选，催化性质提高的突变体被用于下一轮进化，最终提高了所用KRED和GDH的活性和稳定性，同时保持了天然KRED近乎完美的对映选择性，提高了HHDH的活性并在很大程度上解除了底物抑制.新的生产工艺满足绿色化学的12项原则.不包含工艺用水时，整个工艺的E因子（每千克产物对应废弃物的质量）为5.8，如果包含工艺用水，E因子为18.在生物催化剂的基础上，这三种酶将还原反应的体积生产率（volumetric productivity，VP）［79］提高了约100倍，将氰化反应的VP提高了约4000倍.这极大地改善了Lipitor?的关键中间体的生产，Codexis公司因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2006年更绿色反应条件奖”［80］. ...
Recommendations for comparison of productivity between fed-batch and perfusion processes
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2019
... 辉瑞的Lipitor?是世界上第一个年销售额超过100亿美元的药物，其活性成分为阿托伐他汀（atorvastatin）［75］.据估计，阿托伐他汀的中间体羟基腈（hydroxynitrile，HN）的年需求量接近20万千克.传统的商业化HN工艺需要动力学拆分（最大收率50%）并且涉及溴化学或不对称氢化的手性池前体合成［76］.由于副产物多，需要高真空分馏来纯化最终产品，导致产量更低.使用腈酶、脂肪酶等的化学酶法合成并未商业化，这类工艺需要用的酶量较多使得产物难以分离，也增加了成本［75］.因此，Codexis开发了二步三酶法制备HN［76］（图3），第一步使用KRED（EC 1.1.1.184）将羰基立体选择性地还原为羟基，并组合NADP依赖的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC 1.1.1.47）用于辅因子再生；第二步使用卤代醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase，HHDH，EC 3.8.1.5）将氯取代为氰基［77-78］.由于这三个酶均不能满足大规模制备HN的需求，因此研究团队使用DNA shuffling构建突变库，在接近生产工艺的条件下进行高通量筛选，催化性质提高的突变体被用于下一轮进化，最终提高了所用KRED和GDH的活性和稳定性，同时保持了天然KRED近乎完美的对映选择性，提高了HHDH的活性并在很大程度上解除了底物抑制.新的生产工艺满足绿色化学的12项原则.不包含工艺用水时，整个工艺的E因子（每千克产物对应废弃物的质量）为5.8，如果包含工艺用水，E因子为18.在生物催化剂的基础上，这三种酶将还原反应的体积生产率（volumetric productivity，VP）［79］提高了约100倍，将氰化反应的VP提高了约4000倍.这极大地改善了Lipitor?的关键中间体的生产，Codexis公司因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2006年更绿色反应条件奖”［80］. ...
Presidential green chemistry challenge: 2006 greener reaction conditions award
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... 辉瑞的Lipitor?是世界上第一个年销售额超过100亿美元的药物，其活性成分为阿托伐他汀（atorvastatin）［75］.据估计，阿托伐他汀的中间体羟基腈（hydroxynitrile，HN）的年需求量接近20万千克.传统的商业化HN工艺需要动力学拆分（最大收率50%）并且涉及溴化学或不对称氢化的手性池前体合成［76］.由于副产物多，需要高真空分馏来纯化最终产品，导致产量更低.使用腈酶、脂肪酶等的化学酶法合成并未商业化，这类工艺需要用的酶量较多使得产物难以分离，也增加了成本［75］.因此，Codexis开发了二步三酶法制备HN［76］（图3），第一步使用KRED（EC 1.1.1.184）将羰基立体选择性地还原为羟基，并组合NADP依赖的葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH，EC 1.1.1.47）用于辅因子再生；第二步使用卤代醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase，HHDH，EC 3.8.1.5）将氯取代为氰基［77-78］.由于这三个酶均不能满足大规模制备HN的需求，因此研究团队使用DNA shuffling构建突变库，在接近生产工艺的条件下进行高通量筛选，催化性质提高的突变体被用于下一轮进化，最终提高了所用KRED和GDH的活性和稳定性，同时保持了天然KRED近乎完美的对映选择性，提高了HHDH的活性并在很大程度上解除了底物抑制.新的生产工艺满足绿色化学的12项原则.不包含工艺用水时，整个工艺的E因子（每千克产物对应废弃物的质量）为5.8，如果包含工艺用水，E因子为18.在生物催化剂的基础上，这三种酶将还原反应的体积生产率（volumetric productivity，VP）［79］提高了约100倍，将氰化反应的VP提高了约4000倍.这极大地改善了Lipitor?的关键中间体的生产，Codexis公司因此获得EPA颁发的“总统绿色化学挑战：2006年更绿色反应条件奖”［80］. ...
Engineering ketoreductases for the enantioselective synthesis of chiral alcohols
1
2023
... 工程化KRED在医药工业中的应用实例还有很多，关于KRED的挖掘、通过改造提升其催化活性和热稳定性［81］、各种辅因子再生方法的优劣以及还原时遵从Prelog规则或反Prelog规则的改造已有文献综述［82］，在此不做赘述. ...
Stairway to stereoisomers: engineering short- and medium-chain ketoreductases to produce chiral alcohols
1
2023
... 工程化KRED在医药工业中的应用实例还有很多，关于KRED的挖掘、通过改造提升其催化活性和热稳定性［81］、各种辅因子再生方法的优劣以及还原时遵从Prelog规则或反Prelog规则的改造已有文献综述［82］，在此不做赘述. ...
Amidases: versatile enzymes in nature
1
2009
... 酰胺酶（amidase，EC 3.5.1.X）对酰胺化合物（包括脂肪酰胺、杂环酰胺和芳香酰胺等）的C—N键具有水解和酰基转移的活性［83］，是合成手性羧酸、α-氨基酸和酰胺的多功能生物催化剂.酰胺酶因其高活性和优异的对映体选择性而被广泛开发和研究，在制药和农药工业具有广泛应用.研究发现，不同物种来源酰胺酶的底物谱差异较大，根据底物偏好性，可以将酰胺酶分为几个亚家族：青霉素酰胺酶（3.5.1.11）、烟酰胺酶（3.5.1.19）、甲酰胺酶（3.5.1.49）等［84］. ...
Amidase as a versatile tool in amide-bond cleavage: from molecular features to biotechnological applications
1
2020
... 酰胺酶（amidase，EC 3.5.1.X）对酰胺化合物（包括脂肪酰胺、杂环酰胺和芳香酰胺等）的C—N键具有水解和酰基转移的活性［83］，是合成手性羧酸、α-氨基酸和酰胺的多功能生物催化剂.酰胺酶因其高活性和优异的对映体选择性而被广泛开发和研究，在制药和农药工业具有广泛应用.研究发现，不同物种来源酰胺酶的底物谱差异较大，根据底物偏好性，可以将酰胺酶分为几个亚家族：青霉素酰胺酶（3.5.1.11）、烟酰胺酶（3.5.1.19）、甲酰胺酶（3.5.1.49）等［84］. ...
Biocatalytic hydrolysis of chlorinated nicotinamides by a superior AS family amidase and its application in enzymatic production of 2-chloronicotinic acid
4
2018
... 2-氯烟酸是一种重要的医药和农药中间体，应用范围广，市场需求大.在医药行业，2-氯烟酸作为中间体可用于生产人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）逆转录酶抑制剂奈韦拉平（nevirapine）、非甾体抗炎药尼氟灭酸（niflumic acid）和抗抑郁药物米氮平（mirtazapine）；在农药行业，2-氯烟酸可作为生产除草剂烟嘧磺隆（nicosulfuron）和吡氟草胺（diflufenican）的中间体［85］. ...

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