荧光原位杂交（FISH）是一种在完整的细胞或组织中，对特定核酸序列进行原位定位与分析的技术［90］。其基本原理是利用荧光标记探针与目标序列的特异性杂交。为了提高检测灵敏度，尤其是在检测低丰度RNA时，研究者开发了多种信号放大策略。图1便展示了一种典型的信号放大技术［91］，它通过设计多级探针的级联杂交来显著增强荧光信号。然而，尽管这类先进技术提升了检测的灵敏度，但FISH方法在检测通量和精确定量方面仍存在固有的局限性。一方面，其检测通量较低，一次实验能同时分析的靶标数量有限，难以满足高通量筛选的需求。另一方面，该方法对靶标的精确定量能力有限。其信号输出易受背景噪声、信号淬灭以及复杂酶促或杂交放大过程中潜在变异性的影响，因此通常被认为是一种半定量而非精确的定量工具。