查文龙, 卜兰, 訾佳辰

合成生物学 2024, 5 (3): 631-657. DOI:10.12211/2096-8280.2023-082

摘要（547）

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中药是中华民族的文化瑰宝，也是我国在新药创制领域的重要驱动力。许多中药材来源于稀缺物种，其药效物质的规模化获取困难，是制约中药新药创制研究的重要瓶颈。合成生物学的出现和快速发展为解决这一瓶颈问题提供了新的途径。目前，中药药效物质的合成生物学研究在单个药效分子的生物制备方法上取得了重要进展。中药的药效主要源于多成分作用的叠加和协同，所以药效成分群是中药药效物质的主要形式，然而针对药效成分群的合成生物学研究鲜有报道。建立中药药效成分群合成生物技术的关键是精确调控组成分子的比例，从而产出优质药效成分群。本文首先总结了挥发油、总皂苷、总黄酮、总木脂素、总生物碱等重要类型中药药效成分群形成机制的研究进展。然后，重点以檀香挥发油为例，介绍如何通过酶工程和代谢工程的联合运用实现药效成分群成分比例和产量的双重优化。最后，对中药药效成分群合成生物学领域的未来研究重点进行了展望，包括：（1）加强中药药效成分群生物合成途径解析方面的研究，重点深入阐明复杂药效成分群的形成机制；（2）加强代谢优化手段方面的创新研究，重点揭示未知代谢调控机制并基于此发展创新调控策略；（3）加强酶工程方法学的创新研究，重点发展新型理性设计和定向进化的联用技术以及人工智能辅助的酶工程技术。

通过在颠茄毛状根中饲喂鸟氨酸脱羧酶（ODC）或精氨酸脱羧酶（ADC）的特异性抑制剂，以及分析ODC和ADC基因的表达水平与托品烷生物碱含量的关联性，证明AbODC在托品的生物合成中起主要作用［21］。AbODC催化鸟氨酸脱羧生成腐胺（putrescine）［21］；腐胺经腐胺N-甲基转移酶（AbPMT）和N-甲基腐胺氧化酶（AbMPO）顺序催化，一个氨基被甲基化，另一个氨基被氧化成醛基，从而生成4-氨甲基正丁醛（4-aminomethylbutanal）（图9）［22-23］。在颠茄中发现了两个AbMPO（AbMPO1和AbMPO2），AbMPO1主要在根中表达，而AbMPO2主要在地上部分表达，并且抑制AbMPO1的表达会显著降低莨菪碱和东莨菪碱的含量，因此AbMPO1是托品烷生物碱生物合成的主要功能性N-甲基腐胺氧化酶。4-氨甲基正丁醛通过自发环化，形成N-甲基吡咯啉正离子（N-methylpyrrolinium cation）（图9）［24］。N-甲基吡咯啉正离子和丙二酰辅酶A在非典型Ⅲ型聚酮合酶AbPYKS的催化下生成4-（1-甲基-2-吡咯烷基）-3-氧丁酸［4-（1-methyl-2-pyrrolidinyl）-3-oxobutanoic acid］（图9）［25］。4-（1-甲基-2-吡咯烷基）-3-氧丁酸在托品酮合酶AbCYP82M3的介导下发生氧化和环化反应生成托品酮（tropinone）（图9）［25］。最后，托品酮在托品酮还原酶I（AbTRI）的催化下生成托品（tropine）（图9）［23］。通过解析AbPYKS的同工酶AaPYKS（源于三分三，Anisodus acutangulus）的蛋白晶体结构，阐明了该类非典型Ⅲ型聚酮合酶的催化机制。AaPYKS活性口袋内的保守三联体Cys166-His305-Asn338负责产生关键中间体3-羰基戊二酸；3-羰基戊二酸与N-甲基吡咯啉正离子通过自发缩合产生4-（1-甲基-2-吡咯烷基）-3-氧丁酸［26］。

苯丙氨酸在苯丙氨酸氨基转移酶（AbArAT4）的催化下生成苯丙酮酸（phenylpyruvate）［112］，随后在苯丙酮酸还原酶（AbPPAR）的催化下生成苯乳酸（phenyllactic acid）［113］，最后在苯乳酸UDP-糖基转移酶（AbUGT1）的催化下发生糖基化反应，生成苯乳酰葡萄糖（phenyllactylglucose）（图9）［114］。

托品和苯乳酰葡萄糖在海螺碱合成酶（AbLS）催化下生成海螺碱（littorine）［114］；海螺碱变位酶（AbCYP80F1）催化重排和氧化反应，生成莨菪醛（hyoscyamine aldehyde）［23，115-116］；莨菪碱-6β-羟化酶（AbH6H）立体选择性地羟基化C6，生成山莨菪碱（anisodamine），并进一步形成三元氧环生成东莨菪碱（图9）［117-118］。通过解析AbHDH的蛋白晶体结构，揭示了其催化机制。AbHDH首先发生变构使锌离子与莨菪醛的醛基产生静电作用；NADPH C4位的pro-R氢负离子转移到莨菪醛的醛基碳上；Ser54的羟基作为广义酸，为与锌离子相互作用的氧提供质子，从而生成莨菪碱［119］（图9）。AbHDH催化的还原反应是可逆的，其还原效率是氧化效率的23.36倍［119］。