查文龙, 卜兰, 訾佳辰

合成生物学 2024, 5 (3): 631-657. DOI:10.12211/2096-8280.2023-082

摘要（547）

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中药是中华民族的文化瑰宝，也是我国在新药创制领域的重要驱动力。许多中药材来源于稀缺物种，其药效物质的规模化获取困难，是制约中药新药创制研究的重要瓶颈。合成生物学的出现和快速发展为解决这一瓶颈问题提供了新的途径。目前，中药药效物质的合成生物学研究在单个药效分子的生物制备方法上取得了重要进展。中药的药效主要源于多成分作用的叠加和协同，所以药效成分群是中药药效物质的主要形式，然而针对药效成分群的合成生物学研究鲜有报道。建立中药药效成分群合成生物技术的关键是精确调控组成分子的比例，从而产出优质药效成分群。本文首先总结了挥发油、总皂苷、总黄酮、总木脂素、总生物碱等重要类型中药药效成分群形成机制的研究进展。然后，重点以檀香挥发油为例，介绍如何通过酶工程和代谢工程的联合运用实现药效成分群成分比例和产量的双重优化。最后，对中药药效成分群合成生物学领域的未来研究重点进行了展望，包括：（1）加强中药药效成分群生物合成途径解析方面的研究，重点深入阐明复杂药效成分群的形成机制；（2）加强代谢优化手段方面的创新研究，重点揭示未知代谢调控机制并基于此发展创新调控策略；（3）加强酶工程方法学的创新研究，重点发展新型理性设计和定向进化的联用技术以及人工智能辅助的酶工程技术。

《中国药典》收录的药材水飞蓟为菊科植物水飞蓟Silybum marianum（L.）Gaertn的干燥成熟果实，具有清热解毒、疏肝利胆的功效。水飞蓟宾类成分是水飞蓟的药效物质，对肝炎等多种肝脏疾病具有显著疗效，其中主要药效成分为水飞蓟宾（silybin）A、水飞蓟宾B以及异水飞蓟宾（isosilybin）A、异水飞蓟宾B。除这四种药效成分外，水飞蓟还含有其他19种结构类似的化合物，致使四种药效成分的定向富集十分困难［12］。水飞蓟宾类化合物的两个生物合成前体紫杉叶素（taxifolin）和松柏醇（coniferyl alcohol）分别属于黄酮和苯丙素。因此，水飞蓟宾类化合物属于黄酮与苯丙素的杂合化合物，其生物合成途径包含了典型的黄酮和苯丙素途径（图11）。水飞蓟中的过氧化物酶（APX1）负责催化紫杉叶素和松柏醇偶联，生成水飞蓟宾A、水飞蓟宾B以及异水飞蓟宾A、异水飞蓟宾B（图11）［124］。因此，APX1是实现水飞蓟宾A、水飞蓟宾B以及异水飞蓟宾A、异水飞蓟宾B四种药效成分定向合成的关键酶。

在水飞蓟宾类成分的生物合成途径中，从酪氨酸到最终产物需要多达15个生物合成酶，并且涉及多种辅因子和毒性中间体。本课题组采用细胞工厂结合体外酶法的策略实现了水飞蓟宾类成分的“从头”合成［120］。首先建立了紫杉叶素和松柏醇的细胞工厂。通过表达莽草酸/芳香氨基酸合成途径中两个关键酶的突变体ScARO4K229L和ScARO7G229S，解除酪氨酸对ScARO4和ScARO7的负反馈抑制作用。重点选择与前体供给、辅因子再生以及细胞耐受等多种因素关联的关键蛋白，开展优化，简化调控环节，从而减轻细胞负荷。例如：通过过表达TYR1和ARO8，既加速了前体化合物酪氨酸的合成，又促进了NADPH和α-酮戊二酸两种辅因子的再生循环；通过过表达ZWF1，既加快了NADPH循环，又显著降低了中间体松柏醛对酵母细胞的毒性（图11）。最终，组合表达6种酵母内源基因以及14种来自于不同植物和细菌的异源基因，构建了紫杉叶素和松柏醇的细胞工厂。最后，采用大肠杆菌表达APX1t，通过体外酶法合成水飞蓟宾类化合物，经大孔吸附树脂纯化后，产率达301 mg/L，并且水飞蓟宾A、水飞蓟宾B以及异水飞蓟宾A、异水飞蓟宾B含量超过90%［120］。从而实现了水飞蓟宾类药效成分的高度富集。