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    2022年 第3卷 第3期    刊出日期:2022-06-30
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    2022, 3(3):  0. 
    摘要 ( 57 )   PDF (684KB) ( 79 )  
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    特约评述
    人工智能辅助的蛋白质工程
    卞佳豪, 杨广宇
    2022, 3(3):  429-444.  doi:10.12211/2096-8280.2021-032
    摘要 ( 1796 )   HTML ( 225)   PDF (2456KB) ( 1893 )  
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    蛋白质工程是合成生物学领域的重要研究方向之一。但目前人类对于蛋白质折叠、酶天然进化机制等基础生物学问题的理解仍很有限,因此基于理性设计方法进行蛋白质的功能从头设计(de novo design)仍然是一个难题。定向进化(directed evolution)通过在实验室模拟自然进化的原理,可以在不依赖结构和机制信息的基础上对蛋白质的功能进行有效优化。但是定向进化高度依赖高通量筛选方法,也限制了其对缺少高通量筛选方法的蛋白质进行改造的能力。近年来,人工智能辅助的蛋白质工程逐渐发展成为一种高效的蛋白质分子设计新策略,在蛋白质的结构预测、功能预测、溶解度预测和指导智能文库设计等多个方面显现出独特的优势,成为理性设计和定向进化之后的又一次技术发展的浪潮。本文综述了近年来人工智能辅助的蛋白质工程的应用进展,对其中的代表性工作进行了重点阐述。在简单介绍了人工智能蛋白质工程策略的原理和流程之后,对数据、分子描述符和人工智能算法等三个影响预测模型性能的关键点进行了分析,总结了该策略中的主要数据库、分子描述符和算法的主流工具包及平台,介绍了它们的功能、用途和网址。我们还对人工智能策略目前仍面临的不足进行了探讨,如高质量数据不足、实验数据存在偏差、缺少通用模型等。随着自动基因功能注释技术、超高通量筛选技术和人工智能算法的不断发展,将会给人工智能辅助的蛋白质工程提供足够的高质量数据和更准确的算法,从而不断提升人工智能辅助的蛋白质工程预测准确度,为合成生物学研究提供更大的助力。

    分子伴侣作用下的蛋白质稳定与进化
    唐宇琦, 叶松涛, 刘嘉, 张鑫
    2022, 3(3):  445-464.  doi:10.12211/2096-8280.2022-013
    摘要 ( 679 )   HTML ( 103)   PDF (2667KB) ( 760 )  
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    新生多肽链通常需要折叠成独特的三维结构来发挥其生物学功能。天然存在的蛋白质仅具有边缘稳定性,少量突变或轻微环境扰动就可能影响蛋白质的正确折叠。蛋白质组的稳定性,即蛋白质稳态,由蛋白质组中较不稳定的蛋白质决定,因而也具有边缘稳定性。蛋白质以及蛋白质组的边缘稳定性决定了细胞内存在着复杂的质量控制机制,用来帮助蛋白质正确折叠、修复或降解错误折叠的蛋白质。本文详细介绍了以热休克蛋白家族为代表的分子伴侣协助蛋白质折叠的内部机制,并回顾了通过过量表达分子伴侣、转录因子等手段提高蛋白质稳态的研究。蛋白质在保持稳定性的同时也在不断进化,本文介绍了蛋白质稳定性与可进化性关系的研究。实验证明,稳定性增强的蛋白质提高了对随机突变的包容度,有助于积累更多突变。相较于野生型蛋白质,这些蛋白质突变体在不同环境的选择下,会产生更多功能适应性突变体,即发生进化。因而蛋白质的稳定性是影响其进化的重要因素。分子伴侣作为蛋白质折叠的参与者,直接协助了蛋白质的定向进化。本文围绕蛋白质折叠的稳定性、蛋白质稳态和蛋白质进化的问题,讨论了以分子伴侣为主的分子机器帮助维持蛋白质稳定、促进蛋白质进化的相关研究。鉴于生物系统的复杂程度,我们对生物进化的理解仍然有限。希望关于影响蛋白质稳定性和可进化性的研究能够为理解蛋白质结构功能的构效关系提供独特见解,同时也为探究蛋白质相关疾病致病机理提供理论基础。

    无细胞蛋白质合成:从基础研究到工程应用
    后佳琦, 姜楠, 马莲菊, 卢元
    2022, 3(3):  465-486.  doi:10.12211/2096-8280.2021-064
    摘要 ( 1304 )   HTML ( 143)   PDF (2584KB) ( 1311 )  
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    无细胞蛋白质合成是无细胞合成生物学的技术核心,亦被称为体外蛋白质翻译,是一种用于补充基于细胞的蛋白质表达的技术。无细胞蛋白质合成系统无需完整的活细胞就可以在体外受控环境中模拟整个细胞的转录和翻译过程,并允许对单个成分和反应网络进行详细深入的研究。因此,无细胞蛋白质合成作为一种平台技术,有望克服当前胞内生产系统中因为细胞膜约束带来的表达局限性,在基础科学研究和应用科学研究中具有广阔的前景。无细胞系统操作简单、便于控制,相对于体内蛋白质表达,其优势还包括其开放特性、消除对活细胞的依赖以及将所有系统物质能量集中在目标蛋白质生产上。本文首先概述了无细胞蛋白质合成系统的组成及基于不同组件类型的无细胞蛋白质合成系统的发展,包括以不同生物提取物为基础的系统以及使用重组元素的蛋白质合成体系。之后介绍了以分批反应、连续交换为代表的无细胞蛋白质合成系统的不同反应模式,阐述了无细胞在基因电路、蛋白质工程和人工“生命体系”构建中的应用和研究进展。其中,基因电路主要概述了无细胞技术在原型设计、生物传感、代谢工程三个方面的最新应用;蛋白质工程依次罗列了无细胞技术在膜蛋白、类病毒颗粒、翻译后修饰、非天然氨基酸嵌入以及蛋白质进化等方面的应用拓展;在人工“生命体系”构建中,噬菌体的合成和人工细胞的构筑开辟了新的前沿领域。最后文章分析了无细胞蛋白质合成系统在未来进一步的科学研究和工业化应用中面临的机遇和挑战。

    蛋白质工程在饲料用酶研发中的应用研究进展
    涂涛, 罗会颖, 姚斌
    2022, 3(3):  487-499.  doi:10.12211/2096-8280.2022-027
    摘要 ( 693 )   HTML ( 110)   PDF (1430KB) ( 615 )  
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    饲料用酶制剂作为饲料添加剂领域最为热门的研究热点之一,以其无残留、无污染、无耐药性等强势优势被广泛推广和应用,极大促进了饲料行业的健康发展。其中,饲料用酶的催化性能是决定其应用功效的核心因素,如何提高饲料用酶的综合性能是饲料用酶制剂研发过程中面临的关键科学问题之一。本文从饲料用酶的实际应用需求出发,聚焦饲料用酶的热稳定性、pH依赖性、蛋白酶抗性和催化活性等4个方面,综述了计算机辅助的蛋白质理性设计技术在饲料用酶制剂研发中的应用研究进展,介绍了用于提升饲料用酶催化性能的有效分子设计策略。通过蛋白质工程技术在关键饲料用酶制剂研发中的应用案例介绍,展示了基于结构基础的酶分子设计技术在饲料用酶制剂研发中的应用前景。与此同时,作为一种应用导向极强的饲料添加剂,利用合成生物学的思想从酶蛋白全局角度出发综合提升饲料用酶催化性能的发展方向,将推动饲料用酶制剂环境适应性分子设计的研发迈向新的台阶。

    酶催化在维生素及其衍生物制备中的应用
    王盼盼, 于洪巍
    2022, 3(3):  500-515.  doi:10.12211/2096-8280.2021-070
    摘要 ( 632 )   HTML ( 72)   PDF (1279KB) ( 583 )  
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    酶是一种天然的催化剂,与化学催化剂相比,酶往往具有独特而卓越的催化性能。对酶的挖掘、改造和应用一直是生物工程重要研究方向。随着酶的挖掘和改造技术不断发展进步,酶催化技术在工业上的应用范围也越来越广。在维生素工业生产中,维生素C和维生素B12早已实现发酵法生产,而维生素B2在21世纪初也由化学合成转向发酵法生产。除上述维生素外,其他维生素均主要采用化学路线合成。而在维生素的化学合成路径中,酶催化替代化学催化的案例越来越多,比如维生素B3、维生素B5和维生素D3的合成,以及维生素酯类和糖苷类衍生物的合成。所涉及的酶种类包括酯水解酶、天冬氨酸酶、P450酶和脂肪酶等。本文对酶的筛选和改造方法做了总结,综述了酶催化技术在维生素及其衍生物合成中的应用。随着对酶催化机制的深入理解,化学工程、计算机辅助设计等多学科交叉融合,酶催化技术将在维生素及其他天然产物的合成方面发挥其独特优势。

    亚胺还原酶在手性胺合成中的应用
    杨璐, 瞿旭东
    2022, 3(3):  516-529.  doi:10.12211/2096-8280.2021-054
    摘要 ( 1105 )   HTML ( 93)   PDF (2499KB) ( 1065 )  
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    手性胺存在于许多生物活性物质中,是重要的手性助剂,同时也是合成天然产物及手性药物的关键中间体。2019年零售额前200名的药物中,含有手性胺结构的药物超过三成,因此发展高效、便捷合成手性胺化合物的方法是研究的重要方向。通过酶催化方法制备手性胺化合物,因具有高效性、环境友好性、经济效率高等优点,获得了学术界及工业界的广泛关注。本文所综述的亚胺还原酶(IREDs)是一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶,可催化亚胺的不对称还原合成手性胺。IREDs具有催化效率高、区域及立体选择性强等优异的特性,在众多合成手性胺方法中脱颖而出,吸引了科研工作者的研究目光。近年来,随着生物信息学、结构生物学、高通量筛选方法的飞速发展和数据库的不断扩充,鉴定了许多不同功能的IRED,并在IRED的发现、分子改造、底物谱扩展和多酶级联应用等方面均取得了显著的成果,其中不乏一些具有工业应用价值。本文概述了IRED的结构特征及作用机理,着重介绍了IRED的分子改造和在多酶串联反应中的应用,以及在不对称催化手性胺生物合成中遇到的瓶颈、获得的突破和进展。此外还对酶法合成手性胺化合物实现工业化生产所面临的挑战及巨大潜力,以及新颖的人工生物合成途径设计对克服这些挑战的重要性进行了展望。

    生物催化惰性碳氢键的氘代反应研究进展
    楼玉姣, 徐鉴, 吴起
    2022, 3(3):  530-544.  doi:10.12211/2096-8280.2021-067
    摘要 ( 331 )   HTML ( 31)   PDF (3026KB) ( 391 )  
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    氘代化合物在代谢组学、蛋白质组学以及合成化学中的机理研究等方面都有重要的应用。由于C—D键比C—H键更稳定,可以显著提高氘代药物的体内代谢稳定性和生物半衰期,而随着2017年第1个氘代药物丁苯那嗪上市,氘代化合物的重要性进一步被人们关注,国内外许多研究机构都开启了氘代药的研究。氘代化合物的合成方法通常有化学法和生物法两种,由于生物酶与传统的化学催化剂相比具有绿色、低毒、节约成本等优势,并且具有突出的立体选择性,生物催化方法受到了越来越多的关注。本文重点综述了目前已报道的合成氘代化合物的生物催化方法,主要包括生物催化氢氘交换、还原氘代、脱羧氘代等3类反应,这些反应的基本模式都是从氘代水溶剂中汲取氘代质子转移到惰性碳氢键的特定氢原子上。虽然生物酶法制备氘代化合物的研究才刚刚起步,鉴于氘代分子在医药、化学中的重要地位,生物催化氘代反应在未来将会得到越来越广泛的应用。

    Fe/α-酮戊二酸依赖型卤化酶在绿色卤化反应中的研究进展
    王汇滨, 车昌丽, 游松
    2022, 3(3):  545-566.  doi:10.12211/2096-8280.2021-102
    摘要 ( 532 )   HTML ( 49)   PDF (3220KB) ( 543 )  
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    将卤素原子引入药物、农药等小分子中可以有效提升其生物活性,并且碳卤键可用于有机合成后期功能化反应。Fe/α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,αKG)依赖型卤化酶可以高立体选择性和区域选择性催化卤素原子引入到未经活化的sp3杂化碳中心。大自然是最伟大的化学家,本文遵循从学习自然到改造自然的逻辑顺序,首先介绍Fe/αKG依赖型卤化酶的发现历程,之后分别总结天然产物生物合成途径中的载体依赖型和独立型Fe/αKG依赖型卤化酶,进一步分析Fe/αKG依赖型卤化酶的结构特征以及基于蛋白质工程等方法改造扩展其底物谱并拓展新的反应类型,最后从新酶的挖掘与表征、酶催化活性的提升、酶区域选择性的控制、酶反应类型的拓展、人工生物合成途径的创建等5方面进行展望,丰富对Fe/αKG依赖型卤化酶的催化机制、底物范围和反应杂泛性的相关认识,为后续合成生物学的应用研究奠定酶学基础。

    预反应态模型浅析:催化活性和近过渡态分子模拟
    SIM Byuri, 赵一雷
    2022, 3(3):  567-586.  doi:10.12211/2096-8280.2021-013
    摘要 ( 925 )   HTML ( 46)   PDF (1963KB) ( 762 )  
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    当今生物合成催化元件超进化分子理性设计的瓶颈在于有限的计算资源、研究时间与催化反应复杂势能面接近无穷无尽的计算需求之间的矛盾。然而,两个前所未有的数据集合有望拓新蛋白质工程人工智能化分子设计,其一是高通量定向进化实验带来的巨量高效突变体序列信息,其二是基于结构生物学的高阶量子力学计算所揭示的全原子飞秒精度反应机制。本文从催化基本理论、米氏复合物近进攻构象、催化循环效率控制点的角度浅析预反应态模型的基本概念和应用。预反应态模型尝试利用在低反应势垒生物化学反应中内禀的近进攻构象与过渡态具有相近的物理化学稳定性,弹性地选择与催化元件进化目标相关的关键过渡态,利用经典分子动力学模拟分析近过渡态的活性构象布居数与远端突变、底物结构、实验条件的关系。预反应态分析的基本流程为:首先,基于高阶量子力学反应势能面提取催化中心关键过渡态的结构特征;其次,从高精度蛋白质三维结构出发,结合氨基酸质子化生物信息学预测工具构建出关键过渡态对应的近进攻态活性构象;最后,利用过渡态结构特征设定分子动力学模拟初始约束条件,并逐步取消约束条件测试预反应态随氨基酸突变和底物变化的稳定性变化,以近进攻构象在预反应态轨迹中布居数作为“预反应态-酶活”半定量相关系数,从预反应态稳定性中挖掘酶与底物的适配图谱。当前在预反应态动态结构与酶活的定量关系分析上还有诸多难题亟待突破,利用高通量高阶量子化学再采样计算、结合机器学习人工智能分析代表了预反应态模型的发展方向。

    研究论文
    还原伴侣对细胞色素P450酶MycG功能调控的研究
    杨超凡, 姜玉超, 桑茉莉, 李盛英, 张伟
    2022, 3(3):  587-601.  doi:10.12211/2096-8280.2021-053
    摘要 ( 881 )   HTML ( 63)   PDF (2502KB) ( 698 )  
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    细胞色素P450酶负责催化许多天然产物生物合成过程中的关键反应,是自然界中最具催化多样性的生物催化剂。还原伴侣蛋白对P450催化功能至关重要,在进化过程中两者之间通过融合或分离方式演化出多种不同的催化系统。还原伴侣与P450酶的适配性往往是造成P450酶功能重建失败或低效的关键因素,也能够影响和改变P450酶的催化功能和性质。不同还原伴侣与P450酶的组合与互作如何影响P450酶的催化功能、催化效率和产物分布是值得深入探究的科学问题。本研究以还原伴侣蛋白RhFRED和P450酶MycG为研究对象,通过构建不同的融合和分离蛋白组合,系统研究了还原伴侣与P450酶的适配和相互作用模式对P450酶催化功能的影响。将RhFRED两个结构功能域拆解为两个独立蛋白FMN和Fe2S2,与P450酶MycG三者之间利用还原伴侣工程构建分离或融合型蛋白,通过体外生化反应探究不同组合方式下MycG对底物麦新米星M-Ⅳ催化功能以及电子传递效率的影响。在构建的20个还原伴侣与P450酶的“非天然”催化组合中,16个组合能够成功重建MycG的催化功能,其中12个组合中MycG能够催化产生3种氧化产物麦新米星M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅴ以及1种脱甲基产物dMe-M-Ⅳ;4个组合仅产生氧化产物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅴ;剩余4个组合未检测到任何反应产物。通过模拟自然进化,系统研究了还原伴侣与P450酶构成的3种不同催化系统(单、双、三组分)以及单组分和双组分系统中不同的蛋白组织形式对MycG催化功能和性质的影响,结果表明不同还原伴侣系统和组合/组织方式能够通过蛋白-蛋白相互作用显著影响P450的催化功能、催化效率和催化性质。

    Caulobacter crescentus蔗糖水解酶受体亚位点分子改造及其在松二糖制备中的应用
    王蕾, 邢晨晨, 郭志勇, 宿玲恰, 吴敬
    2022, 3(3):  602-615.  doi:10.12211/2096-8280.2021-047
    摘要 ( 452 )   HTML ( 44)   PDF (3239KB) ( 369 )  
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    松二糖是由葡萄糖与果糖以α-1,3糖苷键连接而成的还原性二糖,具有代替蔗糖成为新型功能性甜味剂的潜力,在食品工业中应用前景广阔。淀粉蔗糖酶能够以蔗糖为底物催化异构(分子内转苷)反应制备松二糖,产率高但易产生副产物麦芽寡糖和海藻酮糖。为解决这一问题,选用前期获得的松二糖产率高并且不产副产物麦芽寡糖的Caulobactercrescentus蔗糖水解酶突变体S271A为研究对象,进一步通过受体亚位点分子改造,获得了反应特异性和松二糖产率提升的突变体S271A/I382Q。在此基础上进行了酶转化条件优化,当以2 mol/L蔗糖溶液为底物,加酶量为40 U/mL,在pH 5.0、30 ℃的条件下,松二糖的产率达到最高为70.3%,松二糖的浓度为480 g/L,并且反应产物中不含副产物海藻酮糖。分子动力学模拟表明,突变体S271A/I382Q可通过氢键相互作用稳定受体果糖参与形成α-1,3糖苷键时的构象,从而更有利于生成松二糖。本研究创新性地将蔗糖水解酶改造为键型特异性强的转苷酶,获得的松二糖产率为目前报道的最高水平,为松二糖的规模化制备与应用奠定了理论和技术基础。