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Studies on hydrogenases for hydrogen production using in vitro synthetic enzymatic biosystems
Synthetic Biology Journal
2024, 5 (6):
1461-1484.
DOI: 10.12211/2096-8280.2024-052
Hydrogenases are the most important enzymes in biological hydrogen production and hydrogen energy utilization. They are widely distributed, oxygen-sensitive, multiunit complexed metal enzymes. In vitro synthetic enzymatic biosystems (ivSEB) is a type of in vitro biotransformation (ivBT) technology, which is an emerging biomanufacturing powerhouse that combines microbial fermentation with enzymatic biocatalysis, allowing for novel and efficient hydrogen production, also breaking the Thauer limit and achieving a yield of hydrogen close to the theoretical value of chemistry (1 mole of glucose to produce 12 moles of hydrogen in maximum). It represents the future direction of biological hydrogen production. However, the recombinant expression of hydrogenase is the main bottleneck limiting the wide application of ivSEB for hydrogen production technology. Hydrogenases are widely distributed in all life domains, but are oxygen-sensitive and mostly consist of metalloproteins with multi-subunits, bearing [Fe] only, [NiFe] or [FeFe] dinuclear core in their catalytic center. Oxygen not only inhibits the activity of hydrogenase, but also affects the transcription of the enzyme-encoding gene and post-translational process of the enzymes. As a result, the levels of recombinant hydrogenase are usually low and the enzymatic activities are also incomparable to the native enzymes, often leading to high production costs due to the strict anaerobic purification procedures. In order to meet the requirements of industrial hydrogen production, hydrogenases must possess excellent catalytic properties, such as a high catalytic turnover number, great thermal stability, and the ability to tolerate trace amounts of oxygen. This review summarizes the studies on the structural and catalytic characterizations of hydrogenases, including their classification, oxygen resistance mechanisms, and progress in recombinant expression. Additionally, the evolution of natural electron transfer chains and the design of artificial routes, which can improve hydrogen production efficiency and reduce costs, are briefly discussed. The review also discussed the progress in the studies on the mechanisms of hydrogenases’ tolerance toward oxygen, the strategies for microbial expression of recombinant hydrogenases as well as the optimization of the artificial electron transfer chains adapted for the production of hydrogen using ivSEB, in expectations of promoting the applications of hydrogenases involved ivSEB, from renewable energy storage, anaerobic artificial respiration, to clean hydrogenation or dehydrogenation in biocatalysis.
Table 2
The activities of the reported recombinant [NiFe] hydrogenases
Extracts from the Article
虽然［FeFe］和［NiFe］氢酶在一级和二级结构上的同源性很低，但是这两类氢酶在催化位点的结构上异曲同工，具有在其催化位点上类似的特征性非蛋白配体，有着共同的电子转移特征，均可以催化氢气和质子、电子之间的相互转化，但是它们参与氢气裂解或合成的方式并不相同，体现了进化中实现的两种独立的解决方案。因此，［FeFe］和［NiFe］氢酶被认为是收敛进化最深刻的案例（收敛进化是指不同物种或群体在相似的环境条件下，独立演化出相似的形态、生理特征或行为的现象）。［FeFe］氢酶主要分布在厌氧发酵微生物中，主要功能是通过产生氢气回收电子，利用氧化电子辅酶的反应使其循环利用，因此是细胞能量代谢的重要组成。而［NiFe］氢酶的功能十分多样，既可产氢也可用氢，或参与还原力的再生等［45， 48］。依据其在细胞中的定位可分为可溶性及膜结合［NiFe］氢酶。可溶的胞内［NiFe］氢酶主要在能量代谢中催化氢气的氧化，可能是早期生命中的关键酶，代表了现代呼吸代谢的前身。［FeFe］或［NiFe］氢酶从细胞内分布的性质均可分为可溶性氢酶或膜结合型氢酶，膜结合型氢酶赋予氢酶更多的功能，可参与细胞最基础的能量转化反应，如组成电子呼吸链等功能，但是胞内可溶氢酶更适合组建ivSEB系统。与［NiFe］类型相比，［FeFe］氢酶催化H2合成的比酶活通常更佳，至少高出一个数量级或更高的效率，然而，该类氢酶对氧气更敏感。这两类金属类型不一的氢酶对氧气的敏感差异比较大，［FeFe］氢酶在存在微量氧气时大多会不可逆地失活，而许多［NiFe］氢酶虽也受氧气抑制，但是在去除氧气后可重新激活［49-50］。基于两类氢酶不同的特性及各自的催化优势，它们已分别应用于不同领域，如［FeFe］氢酶常用于构建氢酶-光催化混合复合体的构建，用于开展H2的光合生产［51-52］。除了产氢特性外，对［NiFe］氢酶的H2氧化活性的研究也用于电化学燃料电池中，这些电池利用生物催化剂替代昂贵的铂催化剂［53］。氢酶还已成功用于H2驱动的辅因子再生系统，用于回收NAD（H）和NADP（H）等昂贵辅酶，其效率高于NADH/NADPH氧化酶且能耗低、无需氧气参与［54］。
为了能够利用氢酶开展应用研究，或者对其催化机理进行深入解析，研究人员需要获取足量的氢酶，但却往往受限于氢酶的胞内浓度不高，或是其原宿主细胞发酵密度低。此外，天然氢酶缺乏利于纯化的亲和标签肽，导致纯化过程中酶活的损失较大，因此，急需对氢酶开展重组表达。几十年以来，研究人员一直在尝试各种表达策略，开展了［FeFe］和［NiFe］氢酶的同源或异源重组生产。但是由于对氢酶翻译后成熟机理的理解不多，2010年以前外源表达功能性的［FeFe］氢酶的尝试只取得了有限的成功，主要是由于异源宿主无法合成完整的H-簇，导致获得的要么是无催化活性的apo-酶［96-97］，或者只能获得活性很低的重组酶［98-99］。但这些初期的尝试让研究人员发现了氢酶表达需要完备的成熟蛋白体系，同时也认识到其对氧的高敏感性带来的纯化挑战，这些前期经验对后期氢酶的重组表达工作积累了宝贵的经验。因此，近十几年来，世界各地研究人员先后通过使用同源和异源宿主成功表达了多种［FeFe］氢酶（表1）或［NiFe］氢酶（表2）。其中，利用成熟的大肠杆菌进行［NiFe］氢酶过表达的突破由美国佐治亚大学的研究组实现，他们在大肠杆菌中过表达高温古菌Pf SHⅠ的四个结构基因和九个成熟基因（hypA、B、F、C、D、E，hycI，slyD，frxA）［43］，实现了有活性高温氢酶的重组生产，并且通过组氨酸标签的使用，大大降低了氢酶的纯化成本和难度。研究还表明，即使在异源重组表达时，也不是所有的氢酶加工蛋白都需要共表达。研究发现，只需过表达结构基因和氢酶大亚基的成熟蛋白酶（FrxA），大肠杆菌就可产生有活性的Pf SHⅠ。重组氢酶的比酶活相比天然氢酶相距较远，这表明在厌氧发酵时，大肠杆菌膜结合氢酶相关成熟蛋白也可参与外源高温氢酶的翻译后加工，尽管其效率不及天然高温成熟蛋白。由此，利用天然宿主（同源重组表达）或其亲缘较近物种进行重组氢酶基因表达，更容易实现功能性氢酶的过表达生产。例如，Desulfovibrio gigas的［NiFe］氢酶可成功地在Desulfovibrio fructosovorans MR400中重组表达，这两种微生物的氢酶亚基显示出64%的同源性和80%的相似性。Song等［45］使用与火球菌P. furiosus亲缘关系相近的Theromococcus kodakarensis KOD1作为底盘细胞，通过穿梭质粒高效表达并纯化了P. furiosus来源的可溶性氢酶SHⅠ。另一来自嗜氢高温菌Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1的［NiFe］氢酶也成功地在常温嗜氢菌Ralstonia euatropha H16中成功表达，并进行了活性氢酶的性能表征［135］。但是利用高温古菌进行同源重组表达也面临微生物发酵密度低、酶表达量不足的困境，因此，开展研究实现高温古菌的高密度发酵，或者着力提升氢酶异源表达的加工效率仍然十分必要［136］。
除了开发蛋白类新型酶种，非多肽仿真人工催化剂的研究也备受重视。例如，仿真人工氢酶可以弥补天然氢酶在应用中的诸多挑战，如获取成本高、对氧超级敏感等。因此，研究人员正着力于通过对氢酶活性中心的结构及化学配位原则进行探究，利用金属有机物设计并模拟出天然氢酶的活性位点，获得可以实现氢气的氧化及质子还原功能的仿真催化剂［141］，这类氢酶仿真催化剂的开发依赖于研究人员对天然氢酶结构和功能的了解。1995年，Volbeda等［142］解析了来自Desulfovivrio gigas的［NiFe］氢酶的首个2.85 ?（1 ?=0.1 nm）晶体结构，推动了氢酶仿真物的研究，开发出了一系列模拟复合物作为H2生产的催化剂。同时有研究表明，［FeFe］氢酶在质子还原为H2的过程中效率最高，其转化频率可高达104 s-1［143］，研究人员通过模拟H簇的双铁位点，使用azadithiolate（ADT）连接［FeFe］氢酶的两个铁原子后，实现［FeFe］氢酶金属簇的仿生模拟［144］。
①通过连二亚硫酸钠还原的MV每毫克蛋白质每分钟产生的氢气（μmol）. ... [FeFe] hydrogenases and their evolution: a genomic perspective 1 2007 ... ［FeFe］和［NiFe］氢酶均可以催化产氢反应，其中［FeFe］氢酶广泛存在于厌氧细菌或含有光合细胞器的真核生物中，且原先认为在古细菌中不存在［FeFe］氢酶［ Minimal and hybrid hydrogenases are active from Archaea 1 2024 ... ［FeFe］和［NiFe］氢酶均可以催化产氢反应，其中［FeFe］氢酶广泛存在于厌氧细菌或含有光合细胞器的真核生物中，且原先认为在古细菌中不存在［FeFe］氢酶［ Exceptionally high rates of biological hydrogen production by biomimetic in vitro synthetic enzymatic pathways 1 2016 ... 虽然［FeFe］和［NiFe］氢酶在一级和二级结构上的同源性很低，但是这两类氢酶在催化位点的结构上异曲同工，具有在其催化位点上类似的特征性非蛋白配体，有着共同的电子转移特征，均可以催化氢气和质子、电子之间的相互转化，但是它们参与氢气裂解或合成的方式并不相同，体现了进化中实现的两种独立的解决方案.因此，［FeFe］和［NiFe］氢酶被认为是收敛进化最深刻的案例（收敛进化是指不同物种或群体在相似的环境条件下，独立演化出相似的形态、生理特征或行为的现象）.［FeFe］氢酶主要分布在厌氧发酵微生物中，主要功能是通过产生氢气回收电子，利用氧化电子辅酶的反应使其循环利用，因此是细胞能量代谢的重要组成.而［NiFe］氢酶的功能十分多样，既可产氢也可用氢，或参与还原力的再生等［ Characterization of [FeFe] hydrogenase O2 sensitivity using a new, physiological approach 1 2016 ... 虽然［FeFe］和［NiFe］氢酶在一级和二级结构上的同源性很低，但是这两类氢酶在催化位点的结构上异曲同工，具有在其催化位点上类似的特征性非蛋白配体，有着共同的电子转移特征，均可以催化氢气和质子、电子之间的相互转化，但是它们参与氢气裂解或合成的方式并不相同，体现了进化中实现的两种独立的解决方案.因此，［FeFe］和［NiFe］氢酶被认为是收敛进化最深刻的案例（收敛进化是指不同物种或群体在相似的环境条件下，独立演化出相似的形态、生理特征或行为的现象）.［FeFe］氢酶主要分布在厌氧发酵微生物中，主要功能是通过产生氢气回收电子，利用氧化电子辅酶的反应使其循环利用，因此是细胞能量代谢的重要组成.而［NiFe］氢酶的功能十分多样，既可产氢也可用氢，或参与还原力的再生等［ A third type of hydrogenase catalyzing H2 activation 1 2007 ... 虽然［FeFe］和［NiFe］氢酶在一级和二级结构上的同源性很低，但是这两类氢酶在催化位点的结构上异曲同工，具有在其催化位点上类似的特征性非蛋白配体，有着共同的电子转移特征，均可以催化氢气和质子、电子之间的相互转化，但是它们参与氢气裂解或合成的方式并不相同，体现了进化中实现的两种独立的解决方案.因此，［FeFe］和［NiFe］氢酶被认为是收敛进化最深刻的案例（收敛进化是指不同物种或群体在相似的环境条件下，独立演化出相似的形态、生理特征或行为的现象）.［FeFe］氢酶主要分布在厌氧发酵微生物中，主要功能是通过产生氢气回收电子，利用氧化电子辅酶的反应使其循环利用，因此是细胞能量代谢的重要组成.而［NiFe］氢酶的功能十分多样，既可产氢也可用氢，或参与还原力的再生等［ Enzymatic and bioinspired systems for hydrogen production 1 2023 ... 虽然［FeFe］和［NiFe］氢酶在一级和二级结构上的同源性很低，但是这两类氢酶在催化位点的结构上异曲同工，具有在其催化位点上类似的特征性非蛋白配体，有着共同的电子转移特征，均可以催化氢气和质子、电子之间的相互转化，但是它们参与氢气裂解或合成的方式并不相同，体现了进化中实现的两种独立的解决方案.因此，［FeFe］和［NiFe］氢酶被认为是收敛进化最深刻的案例（收敛进化是指不同物种或群体在相似的环境条件下，独立演化出相似的形态、生理特征或行为的现象）.［FeFe］氢酶主要分布在厌氧发酵微生物中，主要功能是通过产生氢气回收电子，利用氧化电子辅酶的反应使其循环利用，因此是细胞能量代谢的重要组成.而［NiFe］氢酶的功能十分多样，既可产氢也可用氢，或参与还原力的再生等［ A surface-display biohybrid approach to light-driven hydrogen production in air 1 2018 ... 虽然［FeFe］和［NiFe］氢酶在一级和二级结构上的同源性很低，但是这两类氢酶在催化位点的结构上异曲同工，具有在其催化位点上类似的特征性非蛋白配体，有着共同的电子转移特征，均可以催化氢气和质子、电子之间的相互转化，但是它们参与氢气裂解或合成的方式并不相同，体现了进化中实现的两种独立的解决方案.因此，［FeFe］和［NiFe］氢酶被认为是收敛进化最深刻的案例（收敛进化是指不同物种或群体在相似的环境条件下，独立演化出相似的形态、生理特征或行为的现象）.［FeFe］氢酶主要分布在厌氧发酵微生物中，主要功能是通过产生氢气回收电子，利用氧化电子辅酶的反应使其循环利用，因此是细胞能量代谢的重要组成.而［NiFe］氢酶的功能十分多样，既可产氢也可用氢，或参与还原力的再生等［ Redox-polymer-based high-current-density gas-diffusion H2-oxidation bioanode using [FeFe] hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans in a membrane-free biofuel cell 1 2020 ... 虽然［FeFe］和［NiFe］氢酶在一级和二级结构上的同源性很低，但是这两类氢酶在催化位点的结构上异曲同工，具有在其催化位点上类似的特征性非蛋白配体，有着共同的电子转移特征，均可以催化氢气和质子、电子之间的相互转化，但是它们参与氢气裂解或合成的方式并不相同，体现了进化中实现的两种独立的解决方案.因此，［FeFe］和［NiFe］氢酶被认为是收敛进化最深刻的案例（收敛进化是指不同物种或群体在相似的环境条件下，独立演化出相似的形态、生理特征或行为的现象）.［FeFe］氢酶主要分布在厌氧发酵微生物中，主要功能是通过产生氢气回收电子，利用氧化电子辅酶的反应使其循环利用，因此是细胞能量代谢的重要组成.而［NiFe］氢酶的功能十分多样，既可产氢也可用氢，或参与还原力的再生等［ Hydrogenase-based oxidative biocatalysis without oxygen 1 2023 ... 虽然［FeFe］和［NiFe］氢酶在一级和二级结构上的同源性很低，但是这两类氢酶在催化位点的结构上异曲同工，具有在其催化位点上类似的特征性非蛋白配体，有着共同的电子转移特征，均可以催化氢气和质子、电子之间的相互转化，但是它们参与氢气裂解或合成的方式并不相同，体现了进化中实现的两种独立的解决方案.因此，［FeFe］和［NiFe］氢酶被认为是收敛进化最深刻的案例（收敛进化是指不同物种或群体在相似的环境条件下，独立演化出相似的形态、生理特征或行为的现象）.［FeFe］氢酶主要分布在厌氧发酵微生物中，主要功能是通过产生氢气回收电子，利用氧化电子辅酶的反应使其循环利用，因此是细胞能量代谢的重要组成.而［NiFe］氢酶的功能十分多样，既可产氢也可用氢，或参与还原力的再生等［ Redox active motifs in selenoproteins 1 2014 ... 另有一些［NiFe］氢酶的活性位点中含有硒代半胱氨酸（Sec），它取代了原有的半胱氨酸（Cys），这类氢酶有时也称为［NiFeSe］氢酶.Sec是Cys的同源氨基酸，几乎只存在于氧化还原酶的结构域中［ The selenocysteine toolbox: a guide to studying the 21st amino acid 1 2022 ... 另有一些［NiFe］氢酶的活性位点中含有硒代半胱氨酸（Sec），它取代了原有的半胱氨酸（Cys），这类氢酶有时也称为［NiFeSe］氢酶.Sec是Cys的同源氨基酸，几乎只存在于氧化还原酶的结构域中［ Selenocysteine in thiol/disulfide-like exchange reactions 1 2013 ... 另有一些［NiFe］氢酶的活性位点中含有硒代半胱氨酸（Sec），它取代了原有的半胱氨酸（Cys），这类氢酶有时也称为［NiFeSe］氢酶.Sec是Cys的同源氨基酸，几乎只存在于氧化还原酶的结构域中［ The direct role of selenocysteine in [NiFeSe] hydrogenase maturation and catalysis 0 2017 Importance of the active site “canopy” residues in an O2-tolerant [NiFe]-hydrogenase 1 2017 ... 另有一些［NiFe］氢酶的活性位点中含有硒代半胱氨酸（Sec），它取代了原有的半胱氨酸（Cys），这类氢酶有时也称为［NiFeSe］氢酶.Sec是Cys的同源氨基酸，几乎只存在于氧化还原酶的结构域中［ Assessing historical and projected carbon balance of Alaska: a synthesis of results and policy/management implications 1 2018 ... 另有一些［NiFe］氢酶的活性位点中含有硒代半胱氨酸（Sec），它取代了原有的半胱氨酸（Cys），这类氢酶有时也称为［NiFeSe］氢酶.Sec是Cys的同源氨基酸，几乎只存在于氧化还原酶的结构域中［ Harnessing selenocysteine to enhance microbial cell factories for hydrogen production 1 2022 ... 另有一些［NiFe］氢酶的活性位点中含有硒代半胱氨酸（Sec），它取代了原有的半胱氨酸（Cys），这类氢酶有时也称为［NiFeSe］氢酶.Sec是Cys的同源氨基酸，几乎只存在于氧化还原酶的结构域中［ O2-independent formation of the inactive states of NiFe hydrogenase 1 2013 ... 氢酶因其高效的产氢或氢电转换性能，在生物产氢及燃料电池开发中起着重要作用，然而对氧的高度敏感性限制了其应用范围.过去三十年间，为了揭示对氧敏感的分子机制，研究人员开展了大量的实验和理论探索［ Structure, function and biosynthesis of O?-tolerant hydrogenases 1 2013 ... 氢酶因其高效的产氢或氢电转换性能，在生物产氢及燃料电池开发中起着重要作用，然而对氧的高度敏感性限制了其应用范围.过去三十年间，为了揭示对氧敏感的分子机制，研究人员开展了大量的实验和理论探索［ Characterization of a unique [FeS] cluster in the electron transfer chain of the oxygen tolerant [NiFe] hydrogenase from Aquifex aeolicus 1 2011 ... 对［NiFe］氢酶的氧失活机制研究发现，如同［FeFe］氢酶那样，氧气也会进入并结合到氢酶的活性位点，但对已知的具有氧气耐受性的［NiFe］氢酶来说，这种结合是可逆的，不会导致酶的不可逆降解；通常氧气会迅速通过利用质子和电子还原为水分子，并留下一个羟基固定在活性位点上，然后消耗一组质子和电子以另一个水分子的形式去除羟基［ How the oxygen tolerance of a [NiFe]-hydrogenase depends on quaternary structure 1 2016 ... 氢酶因其高效的产氢或氢电转换性能，在生物产氢及燃料电池开发中起着重要作用，然而对氧的高度敏感性限制了其应用范围.过去三十年间，为了揭示对氧敏感的分子机制，研究人员开展了大量的实验和理论探索［ Mechanism of O2 diffusion and reduction in FeFe hydrogenases 3 2017 ... 氢酶因其高效的产氢或氢电转换性能，在生物产氢及燃料电池开发中起着重要作用，然而对氧的高度敏感性限制了其应用范围.过去三十年间，为了揭示对氧敏感的分子机制，研究人员开展了大量的实验和理论探索［
①通过连二亚硫酸钠还原的MV每毫克蛋白质每分钟产生的氢气（μmol）. ... Molecular characterization and transcriptional analysis of the putative hydrogenase gene of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 1 1996 ... 为了能够利用氢酶开展应用研究，或者对其催化机理进行深入解析，研究人员需要获取足量的氢酶，但却往往受限于氢酶的胞内浓度不高，或是其原宿主细胞发酵密度低.此外，天然氢酶缺乏利于纯化的亲和标签肽，导致纯化过程中酶活的损失较大，因此，急需对氢酶开展重组表达.几十年以来，研究人员一直在尝试各种表达策略，开展了［FeFe］和［NiFe］氢酶的同源或异源重组生产.但是由于对氢酶翻译后成熟机理的理解不多，2010年以前外源表达功能性的［FeFe］氢酶的尝试只取得了有限的成功，主要是由于异源宿主无法合成完整的H-簇，导致获得的要么是无催化活性的apo-酶［ Complete activity profile of Clostridium acetobutylicum [FeFe]-hydrogenase and kinetic parameters for endogenous redox partners 2 2007 ... References
①通过连二亚硫酸钠还原的MV每毫克蛋白质每分钟产生的氢气（μmol）. ... Enzymatic and spectroscopic properties of a thermostable [NiFe]- hydrogenase performing H2-driven NAD+-reduction in the presence of O2 1 2018 ... 为了能够利用氢酶开展应用研究，或者对其催化机理进行深入解析，研究人员需要获取足量的氢酶，但却往往受限于氢酶的胞内浓度不高，或是其原宿主细胞发酵密度低.此外，天然氢酶缺乏利于纯化的亲和标签肽，导致纯化过程中酶活的损失较大，因此，急需对氢酶开展重组表达.几十年以来，研究人员一直在尝试各种表达策略，开展了［FeFe］和［NiFe］氢酶的同源或异源重组生产.但是由于对氢酶翻译后成熟机理的理解不多，2010年以前外源表达功能性的［FeFe］氢酶的尝试只取得了有限的成功，主要是由于异源宿主无法合成完整的H-簇，导致获得的要么是无催化活性的apo-酶［ Strategies for reliable and improved large-scale production of Pyrococcus furiosus with integrated purification of hydrogenaseⅠ 1 2014 ... 为了能够利用氢酶开展应用研究，或者对其催化机理进行深入解析，研究人员需要获取足量的氢酶，但却往往受限于氢酶的胞内浓度不高，或是其原宿主细胞发酵密度低.此外，天然氢酶缺乏利于纯化的亲和标签肽，导致纯化过程中酶活的损失较大，因此，急需对氢酶开展重组表达.几十年以来，研究人员一直在尝试各种表达策略，开展了［FeFe］和［NiFe］氢酶的同源或异源重组生产.但是由于对氢酶翻译后成熟机理的理解不多，2010年以前外源表达功能性的［FeFe］氢酶的尝试只取得了有限的成功，主要是由于异源宿主无法合成完整的H-簇，导致获得的要么是无催化活性的apo-酶［ [NiFe]-hydrogenase maturation in vitro: analysis of the roles of the HybG and HypD accessory proteins 1 1 2014 ... 近年来，无细胞蛋白表达技术的进步也让研究人员开始寻求使用体外加工途径开展氢酶的翻译后成熟，Pagnier等［ [FeFe]- hydrogenase in vitro maturation 1 2022 ... 近年来，无细胞蛋白表达技术的进步也让研究人员开始寻求使用体外加工途径开展氢酶的翻译后成熟，Pagnier等［ Synthetic cascades are enabled by combining biocatalysts with artificial metalloenzymes 1 2013 ... 近年来，无细胞蛋白表达技术的进步也让研究人员开始寻求使用体外加工途径开展氢酶的翻译后成熟，Pagnier等［ Artificial metalloenzymes based on protein assembly 1 2022 ... 近年来，无细胞蛋白表达技术的进步也让研究人员开始寻求使用体外加工途径开展氢酶的翻译后成熟，Pagnier等［ Artificial hydrogenase: biomimetic approaches controlling active molecular catalysts 1 2015 ... 除了开发蛋白类新型酶种，非多肽仿真人工催化剂的研究也备受重视.例如，仿真人工氢酶可以弥补天然氢酶在应用中的诸多挑战，如获取成本高、对氧超级敏感等.因此，研究人员正着力于通过对氢酶活性中心的结构及化学配位原则进行探究，利用金属有机物设计并模拟出天然氢酶的活性位点，获得可以实现氢气的氧化及质子还原功能的仿真催化剂［ Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas 1 1995 ... 除了开发蛋白类新型酶种，非多肽仿真人工催化剂的研究也备受重视.例如，仿真人工氢酶可以弥补天然氢酶在应用中的诸多挑战，如获取成本高、对氧超级敏感等.因此，研究人员正着力于通过对氢酶活性中心的结构及化学配位原则进行探究，利用金属有机物设计并模拟出天然氢酶的活性位点，获得可以实现氢气的氧化及质子还原功能的仿真催化剂［ Novel [FeFe]-hydrogenase mimics: unexpected course of the reaction of ferrocenyl α-thienyl thioketone with Fe3(CO)12 1 2022 ... 除了开发蛋白类新型酶种，非多肽仿真人工催化剂的研究也备受重视.例如，仿真人工氢酶可以弥补天然氢酶在应用中的诸多挑战，如获取成本高、对氧超级敏感等.因此，研究人员正着力于通过对氢酶活性中心的结构及化学配位原则进行探究，利用金属有机物设计并模拟出天然氢酶的活性位点，获得可以实现氢气的氧化及质子还原功能的仿真催化剂［ Current state of [FeFe]-hydrogenase research: biodiversity and spectroscopic investigations 1 2020 ... 除了开发蛋白类新型酶种，非多肽仿真人工催化剂的研究也备受重视.例如，仿真人工氢酶可以弥补天然氢酶在应用中的诸多挑战，如获取成本高、对氧超级敏感等.因此，研究人员正着力于通过对氢酶活性中心的结构及化学配位原则进行探究，利用金属有机物设计并模拟出天然氢酶的活性位点，获得可以实现氢气的氧化及质子还原功能的仿真催化剂［ 体外生物转化(ivBT):生物制造的新前沿 2 2024 ... 体外多酶分子机器是一种由多个酶分子构建的无细胞（或胞外）催化系统［
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