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CRISPR/Cas systems and their applications in gene editing with filamentous fungi
Yingying CHEN, Yang LIU, Junjie SHI, Junying MA, Jianhua JU
Synthetic Biology Journal    2024, 5 (3): 672-693.   DOI: 10.12211/2096-8280.2023-097
Abstract   (629 HTML64 PDF(pc) (2544KB)(480)  

Filamentous fungi, which present distinct morphology and cell structure, play a critical role in human health as well as industrial and agricultural production. However, the unique characteristics of filamentous fungi make them difficult to be manipulated with traditional genetic engineering methods. Thus, the development of an efficient gene editing system is essential for exploring biological resources and understanding metabolic processes in filamentous fungi. The development of the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein (CRISPR/Cas) system promotes more efficient and effective gene editing in different species, and brings a revolutionary breakthrough in fungal fundamental research and applications. In this review, we first briefly introduce the history, working mechanism, and classifications of the CRISPR/Cas mediated gene editing system. Next, we comment the functional components of CRISPR/Cas9 such as selective marker, Cas9 and gRNA and the delivery methods of these components in various filamentous fungi. Furthermore, we systematically discuss the applications of CRISPR related technologies, including CRISPR/Cas12, base-editor, CRISPRa, CRISPRi and CRISPR mediated epigenetic regulation, in the genetic engineering of filamentous fungi, particularly in marine-derived filamentous fungi. Finally, we address challenges with relative low gene editing efficiency and off-targets effects in engineering filamentous fungi, and highlight the potential solutions for developing novel CRISPR/Cas-based gene editing systems. This review can provide guidance for developing an efficient gene editing platform in filamentous fungi and pave the way for further exploration of the secondary metabolites and establishment of robust fungal cell factories.


Fig. 3 Applications of next-generation CRISPR technologies in engineering filamentous fungi
Extracts from the Article
自2012年CRISPR/Cas技术开发以来,科学家们不断地为CRISPR工具箱添砖加瓦,目前以CRISPR/Cas为基础开发的多个基因编辑/调控技术,如CRISPR/Cas12a、CRISPR单碱基编辑器(CRISPR base editor)、CRISPR基因调控技术等都在丝状真菌中得以应用(图3),推动并加速了丝状真菌的遗传改造和基因功能解析。
CRISPR/Cas除了可用上述的基因编辑功能来灭活各种调控因子或替换启动子进而影响基因的表达,还可将丧失切割活性但仍具有RNA引导下与DNA结合能力的Cas蛋白突变体(dCas9/12)与各种效应因子融合来实现位点特异性基因调控[125]。由dCas介导的转录调控不会引起双链或单链的断裂,从而避免对宿主细胞的伤害,在转录调控方面具有巨大的应用前景。目前,已与dCas9/12融合并应用于丝状真菌的调控因子主要包括转录激活因子、抑制因子和表观遗传修饰因子(图3),具体信息综述如下。
碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上,将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合,实现不同碱基的转换,最初是由David Liu团队在2016年 开发[116-118].武汉大学孙宇辉团队[119]已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍,在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前,丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入(knock-in)并替换完成[69120].虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换,但其效率较低.与之相比,单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率,在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景[121].迄今为止,研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器,其中使用较为广泛的主要有两种类型:腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变[122].目前,碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少,且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage
1
2016
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上,将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合,实现不同碱基的转换,最初是由David Liu团队在2016年 开发[116-118].武汉大学孙宇辉团队[119]已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍,在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前,丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入(knock-in)并替换完成[69120].虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换,但其效率较低.与之相比,单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率,在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景[121].迄今为止,研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器,其中使用较为广泛的主要有两种类型:腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变[122].目前,碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少,且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Base editing: advances and therapeutic opportunities
0
2020
Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C: G-to-T: a base editors with higher efficiency and product purity
1
2017
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上,将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合,实现不同碱基的转换,最初是由David Liu团队在2016年 开发[116-118].武汉大学孙宇辉团队[119]已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍,在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前,丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入(knock-in)并替换完成[69120].虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换,但其效率较低.与之相比,单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率,在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景[121].迄今为止,研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器,其中使用较为广泛的主要有两种类型:腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变[122].目前,碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少,且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
碱基编辑技术及其在微生物合成生物学中的应用
1
2023
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上,将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合,实现不同碱基的转换,最初是由David Liu团队在2016年 开发[116-118].武汉大学孙宇辉团队[119]已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍,在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前,丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入(knock-in)并替换完成[69120].虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换,但其效率较低.与之相比,单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率,在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景[121].迄今为止,研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器,其中使用较为广泛的主要有两种类型:腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变[122].目前,碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少,且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Base editing technology and its application in microbial synthetic biology
1
2023
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上,将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合,实现不同碱基的转换,最初是由David Liu团队在2016年 开发[116-118].武汉大学孙宇辉团队[119]已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍,在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前,丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入(knock-in)并替换完成[69120].虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换,但其效率较低.与之相比,单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率,在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景[121].迄今为止,研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器,其中使用较为广泛的主要有两种类型:腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变[122].目前,碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少,且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
CRISPR/Cas9 genome editing to demonstrate the contribution of Cyp51A Gly138Ser to azole resistance in Aspergillus fumigatus
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2018
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上,将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合,实现不同碱基的转换,最初是由David Liu团队在2016年 开发[116-118].武汉大学孙宇辉团队[119]已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍,在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前,丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入(knock-in)并替换完成[69120].虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换,但其效率较低.与之相比,单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率,在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景[121].迄今为止,研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器,其中使用较为广泛的主要有两种类型:腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变[122].目前,碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少,且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases
1
2017
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上,将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合,实现不同碱基的转换,最初是由David Liu团队在2016年 开发[116-118].武汉大学孙宇辉团队[119]已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍,在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前,丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入(knock-in)并替换完成[69120].虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换,但其效率较低.与之相比,单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率,在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景[121].迄今为止,研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器,其中使用较为广泛的主要有两种类型:腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变[122].目前,碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少,且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
CRISPR-Cas9 base editors and their current role in human therapeutics
1
2023
... 碱基编辑器是在CRISPR/Cas系统基础上,将突变型Cas与脱氨酶等其他功能蛋白融合,实现不同碱基的转换,最初是由David Liu团队在2016年 开发[116-118].武汉大学孙宇辉团队[119]已针对碱基编辑器的具体作用原理和发展历程做了详细介绍,在此将不作过多复述.在碱基编辑器未应用于真菌之前,丝状真菌中的碱基替换主要是由CRISPR/Cas介导的外源片段插入(knock-in)并替换完成[69120].虽然利用Cas9介导的敲入技术也可以实现单碱基的替换,但其效率较低.与之相比,单碱基编辑工具则表现出极高的编辑特异性和编辑效率,在高效率定向转换基因组方面具有巨大的应用前景[121].迄今为止,研究者已经开发出多种不同类型的碱基编辑器,其中使用较为广泛的主要有两种类型:腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE),分别可以实现A-to-G和C-to-T此类碱基之间的转变[122].目前,碱基编辑器在丝状真菌中的应用相对较少,且只有胞嘧啶碱基编辑器在有相关应用. ...
Development of an efficient C-to-T base-editing system and its application to cellulase transcription factor precise engineering in thermophilic fungus Myceliophthora thermophila
1
2022
... 胞嘧啶碱基编辑器是将nCas9(nickase Cas9)与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子融合,gRNA引导融合蛋白到靶位点时,暴露出来的非靶向DNA单链上的胞嘧啶C可被脱氨酶转换为尿嘧啶U,而U与胸腺嘧啶T的具有相同的碱基配对规则,在DNA修复时,尿嘧啶糖基化酶抑制子会抑制U→C的修复,提高U转换为T的修复效率,从而完成C→T的碱基转换[60-63].2019年,华南理工大学潘力团队[58]首次将胞嘧啶碱基编辑器应用于黑曲霉中,其编辑效率可达47.36%~100%,且胞嘧啶碱基编辑器在黑曲霉中的靶向编辑窗口略大于其他物种.随后,中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队[123]又进一步在嗜热毁丝霉中构建了三个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(Mtevo-BE4max、MtGAM-BE4max和Mtevo-CDA1).测试结果显示,由海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶融合而成的胞嘧啶碱基编辑器(Mtevo-CDA1)在嗜热毁丝霉中编辑效率要高于另外两个由大鼠嘧啶脱氨酶融合而成的编辑器(Mtevo-BE4max和MtGAM-BE4max).研究人员还利用Mtevo-CDA1深入研究了嗜热毁丝霉中转录调控因子Mtclr-2的功能,发现该蛋白的DNA结合结构域对培养基中纤维素的响应起关键作用,而真菌特异性结构域则与菌丝生长存在密切关系.该研究说明碱基编辑器可为研究丝状真菌中蛋白特殊结构域功能提供另一种高效的编辑工具.近期,美国莱斯大学的高雪团队[124]在丝状真菌中开发了基于胞嘧啶单碱基编辑器的多位点基因编辑系统,该体系利用CBE对功能基因中密码子CAG、CAA、CGA以及反义链中的CCA进行C→T的碱基转换,将终止密码子引入基因序列,致使基因失活,并结合tRNA-gRNA阵列表达体系,实现多个基因的同时失活.该研究利用CBE编辑系统对构巢曲霉中的表观遗传因子进行组合灭活,揭示了多种表观遗传调控因子在真菌次级代谢中的协同调控作用,还筛选到4种新型的天然产物.基于CBE的多位点基因编辑系统显著提高了丝状真菌基因组操作的能力,同时也为挖掘新型真菌活性天然产物提供了新的思路和策略. ...
Multiplex base-editing enables combinatorial epigenetic regulation for genome mining of fungal natural products
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2023
... 胞嘧啶碱基编辑器是将nCas9(nickase Cas9)与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子融合,gRNA引导融合蛋白到靶位点时,暴露出来的非靶向DNA单链上的胞嘧啶C可被脱氨酶转换为尿嘧啶U,而U与胸腺嘧啶T的具有相同的碱基配对规则,在DNA修复时,尿嘧啶糖基化酶抑制子会抑制U→C的修复,提高U转换为T的修复效率,从而完成C→T的碱基转换[60-63].2019年,华南理工大学潘力团队[58]首次将胞嘧啶碱基编辑器应用于黑曲霉中,其编辑效率可达47.36%~100%,且胞嘧啶碱基编辑器在黑曲霉中的靶向编辑窗口略大于其他物种.随后,中国科学院天津工业生物技术研究所田朝光团队[123]又进一步在嗜热毁丝霉中构建了三个不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(Mtevo-BE4max、MtGAM-BE4max和Mtevo-CDA1).测试结果显示,由海七鳃鳗胞嘧啶脱氨酶融合而成的胞嘧啶碱基编辑器(Mtevo-CDA1)在嗜热毁丝霉中编辑效率要高于另外两个由大鼠嘧啶脱氨酶融合而成的编辑器(Mtevo-BE4max和MtGAM-BE4max).研究人员还利用Mtevo-CDA1深入研究了嗜热毁丝霉中转录调控因子Mtclr-2的功能,发现该蛋白的DNA结合结构域对培养基中纤维素的响应起关键作用,而真菌特异性结构域则与菌丝生长存在密切关系.该研究说明碱基编辑器可为研究丝状真菌中蛋白特殊结构域功能提供另一种高效的编辑工具.近期,美国莱斯大学的高雪团队[124]在丝状真菌中开发了基于胞嘧啶单碱基编辑器的多位点基因编辑系统,该体系利用CBE对功能基因中密码子CAG、CAA、CGA以及反义链中的CCA进行C→T的碱基转换,将终止密码子引入基因序列,致使基因失活,并结合tRNA-gRNA阵列表达体系,实现多个基因的同时失活.该研究利用CBE编辑系统对构巢曲霉中的表观遗传因子进行组合灭活,揭示了多种表观遗传调控因子在真菌次级代谢中的协同调控作用,还筛选到4种新型的天然产物.基于CBE的多位点基因编辑系统显著提高了丝状真菌基因组操作的能力,同时也为挖掘新型真菌活性天然产物提供了新的思路和策略. ...
CRISPR technology: a decade of genome editing is only the beginning
1
2023
... CRISPR/Cas除了可用上述的基因编辑功能来灭活各种调控因子或替换启动子进而影响基因的表达,还可将丧失切割活性但仍具有RNA引导下与DNA结合能力的Cas蛋白突变体(dCas9/12)与各种效应因子融合来实现位点特异性基因调控[125].由dCas介导的转录调控不会引起双链或单链的断裂,从而避免对宿主细胞的伤害,在转录调控方面具有巨大的应用前景.目前,已与dCas9/12融合并应用于丝状真菌的调控因子主要包括转录激活因子、抑制因子和表观遗传修饰因子(图3),具体信息综述如下. ...
Modular synthetic biology toolkit for filamentous fungi
1
2021
... CRISPR介导的转录激活(CRISPRa)主要是通过将核酸内切酶失活的dCas9/12与转录激活因子融合,并在gRNA指导下结合到目标基因的启动子区域,从而增强特定基因的表达[126].目前已有多种不同CRISPRa系统被开发出来,这些系统不仅包括转录激活效应子,如VP16、TV(VP128-TALE)、VPR(VP64-p65-Rta)、SunTag(通过抗体募集各种激活因子)等与dCas9融合的系统[127-129],还包括以gRNA为支架的转录激活效应子招募系统[129].虽然各种CRISPRa系统不断被开发出来并表现出良好的调控效果,但是在丝状真菌中的相关研究报道较少,且只有VPR系统有相关应用.VPR系统包含3个转录激活因子:VP64、p65和Rta.其中,VP64是单纯疱疹蛋白16的TAD四聚体,p65是核因子NF-κB蛋白质家族中的成员,Rta(replication and transcription activator,Rta)则是由Y疱疹病毒所编码的转录激活蛋白.将这三种激活因子融合构成的激活元件VP64-p65-Rta(VPR)可显著提高内源性靶标激活水平[127].2020年,Roux等[130]在构巢曲霉中构建了首个CRISPRa系统,该研究将VPR激活元件分别与dCas9和dCas12融合构成CRISPR/dSpCas9-VPR和CRISPR/dLbCas12a-VPR,并分别测试了这两种系统在构巢曲霉中的激活效率.结果表明,dCas12a体系比dCas9具有更好的多基因激活效果,并且通过使用CRISPR/dLbCas12a-VPR激活非核糖体肽合成酶micA基因,提高了微呋喃酮的产量[130].在鲁本斯青霉(P. rubens)中,研究人员则利用CRISPR/dSpCas9-VPR系统,将dSpCas9-VPR结合到转录调控因子macR的启动子上,进而激活沉默基因簇的表达,诱导产生macrophorin类次级代谢物[90].上述研究表明CRISPRa工具在激活真菌沉默基因簇中发挥重要作用,进一步拓展各种CRISPRa激活工具在丝状真菌中的应用将为高值次级代谢产物的挖掘奠定重要基础. ...
Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming
2
2015
... CRISPR介导的转录激活(CRISPRa)主要是通过将核酸内切酶失活的dCas9/12与转录激活因子融合,并在gRNA指导下结合到目标基因的启动子区域,从而增强特定基因的表达[126].目前已有多种不同CRISPRa系统被开发出来,这些系统不仅包括转录激活效应子,如VP16、TV(VP128-TALE)、VPR(VP64-p65-Rta)、SunTag(通过抗体募集各种激活因子)等与dCas9融合的系统[127-129],还包括以gRNA为支架的转录激活效应子招募系统[129].虽然各种CRISPRa系统不断被开发出来并表现出良好的调控效果,但是在丝状真菌中的相关研究报道较少,且只有VPR系统有相关应用.VPR系统包含3个转录激活因子:VP64、p65和Rta.其中,VP64是单纯疱疹蛋白16的TAD四聚体,p65是核因子NF-κB蛋白质家族中的成员,Rta(replication and transcription activator,Rta)则是由Y疱疹病毒所编码的转录激活蛋白.将这三种激活因子融合构成的激活元件VP64-p65-Rta(VPR)可显著提高内源性靶标激活水平[127].2020年,Roux等[130]在构巢曲霉中构建了首个CRISPRa系统,该研究将VPR激活元件分别与dCas9和dCas12融合构成CRISPR/dSpCas9-VPR和CRISPR/dLbCas12a-VPR,并分别测试了这两种系统在构巢曲霉中的激活效率.结果表明,dCas12a体系比dCas9具有更好的多基因激活效果,并且通过使用CRISPR/dLbCas12a-VPR激活非核糖体肽合成酶micA基因,提高了微呋喃酮的产量[130].在鲁本斯青霉(P. rubens)中,研究人员则利用CRISPR/dSpCas9-VPR系统,将dSpCas9-VPR结合到转录调控因子macR的启动子上,进而激活沉默基因簇的表达,诱导产生macrophorin类次级代谢物[90].上述研究表明CRISPRa工具在激活真菌沉默基因簇中发挥重要作用,进一步拓展各种CRISPRa激活工具在丝状真菌中的应用将为高值次级代谢产物的挖掘奠定重要基础. ...

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