Fig. 4
Mechanisms of CRISPR-enabled synthetic biosensors
(a) RNA sensing enabled by reprogrammed tracrRNA in type II CRISPR system[17]; (b) RNA sensing enabled by RNA-triggered RNA processing[142]; (c) RNA sensing enabled by strand displacement reactions[143].
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（1）tracrRNA重编程：II型CRISPR-Cas9系统的向导RNA（gRNA）天然包含两个组分，即CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA），二者可以融合成单链向导RNA（sgRNA）［137］。crRNA 5′端的间隔序列（spacer）决定其DNA靶向性，而3′端与tracrRNA配对区域的原始序列也被证明是可编程的，因此人为设计的重编程tracrRNA可特异性识别并劫持靶标RNA作为crRNA，随后结合核酸内切酶缺陷型Cas9（dCas9）蛋白靶向特定DNA序列［17，138-139］。将这一原理与功能化Cas9变体耦合，可构建多样化生物传感器：例如，Liu等［17，140］将dCas9与转录激活因子融合构建了dCas9激活系统，在此基础上通过重编程tracrRNA劫持细菌内源性环境响应基因转录本（含sRNA和mRNA），进而精确定位dCas9激活系统并触发报告基因的表达，可用于监测砷和锌等环境污染物（图4a）；Jiao等［138］同样基于tracrRNA重编程方法感应内源RNA并结合Cas9切口酶（nCas9）碱基编辑器实现了对合成DNA靶标的精确碱基编辑，成功记录了单细胞的转录历史。
（2）RNA诱导的RNA加工：在dCas9介导的转录抑制系统中，sgRNA通过其间隔序列（spacer）引导dCas9结合至靶DNA区域，通过空间位阻效应阻断RNA聚合酶或转录因子的结合［141］。因此，通过工程化设计sgRNA的二级结构，可实现RNA响应型基因调控：例如Lee等［142］设计了嵌入反义RNA（asRNA）互补序列的工程化sgRNA，当靶asRNA结合时，sgRNA二级结构被破坏并经RNase III切割，从而解除dCas9对报告基因的抑制（图4b）。该策略具有高度灵活性和正交性，但目前仅验证于合成RNA检测。
（3）链置换调控：gRNA的间隔序列若被阻挡或隔离，则无法结合DNA靶标实现CRISPR功能［137］。基于这一原理，研究人员可设计工程化gRNA，使其间隔序列在无靶标RNA时被隔离，而在靶标RNA存在时能够通过链置换重新暴露，进而恢复CRISPR功能以实现基因表达调控［135］（图4c）。典型的例子是结合toehold开关的thgRNA系统［143］，能在感应细菌的外源或内源性RNA时触发CRISPR干扰功能，将靶基因的表达抑制15倍，但其本底泄漏问题显著影响传感器的动态范围。
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