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当期目录

    2023年 第4卷 第1期    刊出日期:2023-02-28
    挑战造物主:合成生物学使能工具
    史硕博, 张翀, 成喜雨, 邢新会
    2023, 4(1):  1-4.  doi:10.12211/2096-8280.2023-012
    摘要 ( 1160 )   HTML ( 406)   PDF (726KB) ( 1150 )  
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    特约评述
    蛋白质稳定性计算设计与定向进化前沿工具
    阮青云, 黄莘, 孟子钧, 全舒
    2023, 4(1):  5-29.  doi:10.12211/2096-8280.2022-038
    摘要 ( 2821 )   HTML ( 352)   PDF (2169KB) ( 3980 )  
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    天然蛋白质具有临界稳定性的特征,这种较低的稳定性使蛋白质结构具有足够的灵活性,从而支持其发挥生物学功能。然而,临界稳定性使得蛋白质遭受胁迫压力后极易发生错误折叠并失去功能,导致天然蛋白质往往无法满足科学研究与工业应用的需求。此外,体内蛋白质在错误折叠后产生的聚集沉淀被认为是多种疾病发生发展的原因,包括阿尔兹海默病、帕金森综合征等。因此,优化蛋白质的稳定性是科学研究与工程应用领域亟待解决的关键问题。本文从蛋白质的折叠与稳定性机制出发,聚焦于序列优化与折叠环境优化两种改善蛋白质稳定性的手段,综述了基于理性设计、计算机辅助设计改善蛋白质稳定性的研究方法,介绍了用于高通量筛选蛋白质稳定化突变体或折叠相关因子的定向进化技术。通过多项蛋白质序列改良、折叠环境优化的案例介绍,展示了蛋白质稳定化技术在蛋白质工程与生物医药领域的广阔应用,包括酶的稳定化设计、疫苗蛋白质的构象控制、分子伴侣与蛋白质聚集抑制剂的筛选、蛋白质稳态药物的开发等。最后,展望了蛋白质稳定化技术未来的研究方向与前景,定制化的蛋白质稳定性检测技术将会迎来蓬勃发展。

    面向微生物遗传操作的编辑序列设计工具的研究进展
    杨毅, 毛雨丰, 杨春贺, 王猛, 廖小平, 马红武
    2023, 4(1):  30-46.  doi:10.12211/2096-8280.2022-055
    摘要 ( 962 )   HTML ( 102)   PDF (2106KB) ( 792 )  
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    以同源重组、CRISPR等为代表的遗传操作技术是合成生物学的重要支撑技术。高效准确的遗传操作依赖于可准确定位编辑位点和实现序列改造的编辑序列(如引物序列、同源臂序列、sgRNA序列等)。由于遗传改造目标与遗传操作技术丰富多变,加之近年来基于生物铸造厂(BioFoundry)的自动化遗传改造模式对高通量设计的需求日益增加,使得通过计算机辅助设计工具实现精准快速的编辑序列设计愈发重要。本文针对不同阶段实现不同目标的微生物遗传操作技术和相应的编辑序列辅助设计工具的发展进行了综述。按照不同编辑序列类型和遗传操作应用场景,将编辑序列设计工具划分为四种类型:引物设计工具、DNA组装的设计工具、sgRNA设计工具、基因组编辑的全流程设计工具,对各类编辑序列设计工具的应用及存在的问题进行了分析总结并对未来的研究方向进行了展望。编辑序列设计工具的发展将有助于实现合成生物学“设计—构建—测试—学习”(design-build-test-learn,DBTL)工作循环中上游的基因型“设计”与下游“构建”两个关键环节之间的无缝衔接。

    CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展
    柳柯, 林桂虹, 刘坤, 周伟, 王风清, 魏东芝
    2023, 4(1):  47-66.  doi:10.12211/2096-8280.2021-022
    摘要 ( 2301 )   HTML ( 214)   PDF (2351KB) ( 1799 )  
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    规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)是一种微生物获得性免疫系统,自从证实其可用于基因编辑之后,迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力,为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发展注入了强劲动力,快速推动了合成生物学等学科的兴盛发展。然而,CRISPR/Cas系统也有一些固有的问题,例如脱靶效应、原间隔序列邻近基序(PAM)对靶目标的约束性以及基因编辑活性的可控性等,严重制约了该系统在基因精准可控编辑等方面的长足发展,阻碍了其新功能和新应用的拓展。为了突破这些限制,“蛋白质工程修饰Cas蛋白”与“基于生物信息学的新型CRISPR/Cas系统的挖掘”就成为完善发展CRISPR/Cas系统以及扩充CRISPR工具箱的两种重要策略。本文主要针对当前应用最为广泛的Ⅱ类CRISPR/Cas系统,重点介绍了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a这三种代表性系统的基本结构和作用机制,及其在结构改造和功能拓展等方面的新进展,同时也对一些新近发掘的具有重要特色和潜在应用价值的CRISPR/Cas系统进行了综述,例如CRISPR/CasФ 和 CRISPR/Cas12k。这些改造和发掘工作显著改善了CRISPR/Cas系统的固有问题,有力地拓展了其功能和适用性,势必会进一步快速推动CRISPR/Cas系统在诸多领域的创新发展。

    CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展
    滕小龙, 史硕博
    2023, 4(1):  67-85.  doi:10.12211/2096-8280.2022-047
    摘要 ( 1581 )   HTML ( 178)   PDF (2359KB) ( 1242 )  
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    CRISPR/Cas9是近年来发展起来的新兴技术,其在多种生物和组织的基因组上具有快速、高效、精准的基因编辑与调控能力,这使得该技术在基础科学和合成生物学等应用科学领域均得到了极大的发展与应用。本文首先对CRISPR的历史沿革、分类及CRISPR/Cas9技术的作用机制进行简述,并结合其原理和在基因组工程中面临的脱靶率高、PAM依赖性强等限制因素总结了近年来针对Cas9蛋白和向导RNA(gRNA)进行的一系列优化与改造。接下来详细叙述了CRISPR/Cas9系统结合效应蛋白实现的多种功能,包括基因表达调控、表观基因组编辑、单碱基编辑等。基于gRNA多表达策略和Cas9多路复用策略,本文还对CRISPR/Cas9技术主要的多重应用成果进行了梳理汇总。最后探讨了CRISPR/Cas9作为高精度基因组编辑工具使用的应用前景,以及作为疗法使用时的安全性和风险控制问题。

    靶向DNA的Ⅱ类CRISPR/Cas系统的蛋白工程化改造
    梁丽亚, 刘嵘明
    2023, 4(1):  86-101.  doi:10.12211/2096-8280.2022-040
    摘要 ( 1106 )   HTML ( 94)   PDF (2003KB) ( 953 )  
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    Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) protein是细菌或古细菌特有的一种获得性免疫系统,自从研究人员将其改造为基因编辑工具之后,CRISPR/Cas系统高效的基因编辑能力对生命科学、生物工程、生物医药、食品及农业科学等多个领域引发了革命性的影响。然而,研究者们发现CRISPR/Cas系统存在脱靶效应、PAM位点识别范围有限等问题,限制了CRISPR/Cas的应用。为了解决这些问题,针对Cas蛋白进行工程化改造已经成为了优化及开发CRISPR/Cas系统的重要策略。本文以Ⅱ类CRISPR/Cas系统中靶向DNA的CRISPR/Cas9以及CRISPR/Cas12a为例,聚焦近年来针对Cas9和Cas12a蛋白的优化改造方法及相关进展进行系统阐述总结,包括Cas蛋白的工程化改造提升基因编辑特异性及改变PAM识别能力,以CRISPR/Cas系统作为基因定位工具开发新功能,结合外源蛋白调控CRISPR/Cas系统功能。这些工作开发了系列高特异性、高精度的CRISPR/Cas系统,极大地扩展了CRISPR/Cas系统的功能及适用范围,为CRISPR/Cas系统的多领域应用做出了重要贡献。

    光遗传学照进生物医学研究进展
    于袁欢, 周阳, 王欣怡, 孔德强, 叶海峰
    2023, 4(1):  102-140.  doi:10.12211/2096-8280.2022-030
    摘要 ( 1676 )   HTML ( 172)   PDF (5941KB) ( 1831 )  
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    近年来,光遗传学技术因具有非侵入性、可逆性、时空特异性等优点被广泛应用于生物医学研究领域,为疾病治疗提供了新思路和新理念。光作为一种理想的基因表达诱导物,以前所未有的时空精度操控基因表达和细胞行为。随着光遗传学技术的深入研究,基于光遗传学的个性化精准治疗和临床转化成为可能。本文主要介绍了响应不同波长的光遗传学工具及其用于神经系统疾病、肿瘤、心血管疾病、糖尿病、肠道疾病等精准治疗和用于控制基因转录表达、基因编辑、基因重组以及细胞器运动等应用。同时也介绍了光遗传学技术与智能电子设备的有机结合及其在便携式生物电子药物、人工智能诊疗方面的最新研究进展。光遗传学的迅速发展极大地拓展了传统生物电子医学领域。光控系统的远程可控性、可逆性和无毒性为光遗传学在生物医学中的应用提供了坚实的基础。这些方法的成功将对未来实践中的精准医疗产生持久的影响。最后探讨了光遗传学工具存在的问题和在未来临床应用面临的挑战,并对其未来发展前景进行了展望。

    RNA转录后代谢时空精密控制技术
    刘韧玫, 李乐诗, 杨小燕, 陈显军, 杨弋
    2023, 4(1):  141-164.  doi:10.12211/2096-8280.2022-050
    摘要 ( 783 )   HTML ( 53)   PDF (4719KB) ( 744 )  
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    RNA种类繁多且功能多样,是细胞活动的核心分子之一。RNA代谢调控对于基因和RNA功能研究、细胞生命活动解析以及疾病治疗手段的开发都是至关重要的。为了深入研究RNA时间、空间分布以及功能机制,科学家们一直在追求可以在活细胞内对RNA分子活动进行精密控制的技术,这也是近些年生命科学领域的研究热点之一。目前基于基因编辑、转录调控等可以控制RNA转录生成的技术已较为成熟,但对于RNA转录后代谢的控制技术尚在发展与突破阶段。此前,RNA转录后代谢调控工具是通过调节RNA或基于RNA结合蛋白的RNA效应因子来实现的,但它们的时空分辨率较低,很难对RNA转录后代谢进行定时、定量和定位精密调控。光遗传学凭借其独特的高时空分辨率、非侵入性等优势已经被逐步用于发展活细胞RNA代谢时空精确控制技术。目前,基于核苷酸光化学修饰、遗传编码光响应因子的光遗传学工具已经可实现在转录或转录后水平对RNA多种代谢活动的时空精密控制,包括生成、运输、翻译、降解等。本文将介绍RNA代谢调控系统的研究进展,并聚焦于RNA转录后代谢的光遗传学调控技术,同时对其未来发展前景进行了展望。

    液滴微流控技术在微生物工程菌株选育中的应用进展
    涂然, 李世新, 李昊霓, 王猛
    2023, 4(1):  165-184.  doi:10.12211/2096-8280.2021-105
    摘要 ( 2302 )   HTML ( 194)   PDF (2702KB) ( 1833 )  
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    微生物工程菌株是生物制造的重要基础,但大多数的工程菌株需要进化改造才能适用于生物制造。在菌种选育过程中,如何高效地筛选获得具有目标性状的微生物工程菌株是进行生物制造应用的关键影响因素之一。液滴微流控技术作为近年来发展起来的一种基于微芯片的高通量检测筛选技术,可以生成大小均一、相互独立的微体积液滴小室,并应用于单细胞的培养、检测和分离,在微生物菌株改造尤其是分泌型菌株的改造中得到广泛应用。本文首先概述液滴微流控技术的组成部分,对关键性的技术进行简要介绍;其次根据液滴检测信号的来源、液滴筛选流程的难易程度和液滴分选仪器的适用范围,对液滴微流控技术在工程菌株选育中的应用进行总结分析;最后对液滴微流控技术在应用中存在的问题和研究方向进行展望,为深化其在微生物合成生物学中的应用提供指导。

    基于核酸和蛋白质生物分子阵列传感器的构建及检测应用的研究进展
    倪伟伟, 周玲佳, 王浩, 李飞, 韩进松
    2023, 4(1):  185-203.  doi:10.12211/2096-8280.2022-035
    摘要 ( 1178 )   HTML ( 90)   PDF (3131KB) ( 798 )  
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    阵列传感器是组合多个传感元件,通过交叉反应机理来区分一类目标分析物的策略,不同于传统探针类传感器“锁-钥”结合模式,阵列传感器为非特异性结合,可实现一对多的识别。然而,传感元件的制备仍然存在设计困难、合成复杂、信号转换效率低等诸多挑战。核酸和蛋白具有优良的生物相容性、灵活的可编程性、易实现的功能化和优越的分子识别性质等优点。目前已经通过合理设计和可控化制备手段构建了多种基于核酸和蛋白类传感元件的阵列传感器,结合机器学习算法对所得数据进行处理,使数据可视化,构建待测物“指纹图谱”,对待测物进行区分。在此综述中,重点介绍了基于核酸和蛋白类传感元件构建的阵列传感器的多目标检测应用,并讨论了其合理的应用前景以及挑战。

    拉曼光谱技术在单细胞表型检测与分选中的应用进展
    王喜先, 孙晴, 刁志钿, 徐健, 马波
    2023, 4(1):  204-224.  doi:10.12211/2096-8280.2022-043
    摘要 ( 1754 )   HTML ( 90)   PDF (2643KB) ( 1507 )  
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    基因组测序、编辑与合成技术日新月异,推动了基因型“设计”和“合成”能力的突飞猛进,同时也使人工细胞的表型检测成为合成生物学发展的瓶颈之一。对于细胞功能的快速测试与评价,单细胞分析技术具有重要意义与前景,但理想的解决方案需要具备活体无损、非标记式、提供全景式表型、能分辨复杂功能、快速高通量且低成本、能与组学分析联动等特征。拉曼光谱技术具备上述所有特征,能够提供单细胞的化学成分组成及分子结构等信息,是一种高效的单细胞表型识别技术。本文首先概述了拉曼组概念和基于拉曼组的细胞功能表型识别,包括代谢产物定性和定量、底物代谢和互作表征、细胞种类和状态鉴定以及环境应激检测等;其次,根据拉曼信号的分类、拉曼信号检测模式和目标细胞分选策略,对现有的拉曼分选平台及其在细胞表型分选中的应用进行分析总结;最后,对单细胞拉曼光谱技术在合成细胞表型检测与分选面临的问题、潜在解决策略进行了探讨和展望。单细胞拉曼光谱技术不仅为细胞工厂的高通量、全景式表型检测与筛选提供了全新的解决方案,还将推动“单细胞精度的表型组-功能基因组”作为一种新的生物大数据类型,服务于“数据科学”驱动下的合成生物技术。

    研究论文
    基因增变器驱动的酿酒酵母基因组连续进化
    潘颖佳, 夏思杨, 董昌, 蔡谨, 连佳长
    2023, 4(1):  225-240.  doi:10.12211/2096-8280.2022-051
    摘要 ( 901 )   HTML ( 89)   PDF (3095KB) ( 660 )  
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    酿酒酵母是工业生物技术最常用的底盘细胞之一,被广泛应用于生物基化学品和高附加值产品的大规模生产。鉴于生物体系代谢和调控网络的复杂性,由多基因协同控制的复杂生理性状的改造通常需要采取全基因组进化来实现。为实现酿酒酵母基因组的快速进化,本研究采用CRISPR干扰技术(CRISPRi)调控与染色体复制和稳定性相关基因(MSH2、TSA1、RAD27CLB5,即增变基因)的表达水平,构建了能够调控酿酒酵母基因组突变率和突变类型的基因增变器。利用基因增变器提高酿酒酵母的β-胡萝卜素合成水平、木糖利用效率和异丁醇耐受性。此外,构建了混合基因增变器和多重基因增变器,进一步探究了不同表型基因组进化所需的最佳突变类型以及不同突变类型之间的协同进化机制。本研究不仅可用于创建高性能酿酒酵母细胞工厂,还有可能发展一个具有普遍适用性的基因组连续进化策略。