合成生物学

本期中英文目录

2021, 2(5): 0.

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天然产物：健康与生态的守护神

李春, 孙文涛, 刘天罡, 邓子新

2021, 2(5): 663-665. doi:10.12211/2096-8280.2021-103

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工程酵母助力真菌嵌合萜类合酶的快速系统挖掘

范震, 潘海学, 唐功利

2021, 2(5): 666-673. doi:10.12211/2096-8280.2021-084

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真菌特有的嵌合萜类合酶（简称为PTTS）由C端异戊烯基转移酶（PT）结构域和N端I型萜类合酶（TS）结构域组成，可直接催化异戊二烯单元产生结构多样的二萜和二倍半萜化合物。自2007年发现第一个PTTS以来，只有约20个PTTS的功能被验证，人们对PTTS的起源和功能进化的认识还十分有限。最近武汉大学刘天罡教授课题组与美国田纳西大学陈峰教授课题组合作，运用高效萜类前体供给的酿酒酵母底盘并结合高通量的自动化平台，对PTTS的起源和功能进化进行了深入系统的探索，扩充了嵌合萜类合酶家族成员的数量，并为萜类化合物的挖掘提供了一个高效的方法。

从化学合成到生物合成——天然产物全合成新趋势

张发光, 曲戈, 孙周通, 马军安

2021, 2(5): 674-696. doi:10.12211/2096-8280.2021-039

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结构复杂而多样的天然产物是药物发现和创制的重要宝库。为了克服有限的自然资源，来自学术界和工业界的科学家近两个世纪一直不断尝试人工合成天然产物。化学全合成已经取得了巨大成就，众多高度复杂的天然产物已经被有机化学家成功制备；但本领域仍存在诸多挑战性问题，例如化学反应中涉及昂贵的化学试剂、苛刻的反应条件、难控的立体选择性、冗长的合成路线以及较低的总收率等。随着合成生物学的发展，越来越多天然产物可通过生物细胞工厂实现人工制备，从而提供全新而互补的全合成策略。本文简要概括天然产物化学全合成，围绕几种药物活性天然产物的生物合成介绍其相关进展，以青霉素、红霉素、阿维菌素为例分析总结了天然产物同源途径的改造与优化；以维生素B₁₂、莨菪烷碱为例概括评述了天然产物的异源表达与生物制造；并以人源胰岛素、青蒿素、沙弗拉霉素、嗜氮酮、卡英酸、鬼臼毒素为例重点介绍了生物与化学交叉融合策略在天然产物全合成中的应用。尽管在类天然产物新分子、立体复杂天然产物等的全合成中仍面临诸多挑战，但生物全合成对这些天然产物分子的构建将发挥越来越显著的作用；通过化学合成与生物合成优势互补，并借助当今蓬勃发展的人工智能技术，实现生物全合成的智能化、自动化、高效化将是本领域发展的新趋势。

基因组挖掘在天然产物发现中的应用和前景

杨谦, 程伯涛, 汤志军, 刘文

2021, 2(5): 697-715. doi:10.12211/2096-8280.2021-012

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天然产物一直以来都是药物先导化合物的重要来源。在药物发现领域，基因组数据常用来识别潜在的药物靶点或寻找先前被忽视的天然产物的生物合成基因簇。尽管基因组测序发现了微生物和植物中存在大量未开发的化学多样性，然而，仅仅利用传统的分离分析方法获取新的天然产物已经无法满足药物发展的需求。随着基因组时代的到来，数字化的基因组挖掘已经成为天然产物发现的重要组成部分。伴随着高通量测序方法的发展和DNA数据的丰富，各种基因组挖掘方法和工具被开发出来，以指导发现和表征这些天然产物。本文综述了近年来基因组挖掘的网络工具、数据库和方法，着重介绍次级代谢产物生物合成基因簇的挖掘手段，从经典的基因组挖掘到基于抗性基因挖掘、基于系统进化发育的挖掘，并对基因组挖掘在天然产物发现中的地位和前景进行了展望。

苄基异喹啉类生物碱的微生物合成研究进展及挑战

林芝, 胡致伟, 瞿旭东, 林双君

2021, 2(5): 716-733. doi:10.12211/2096-8280.2021-058

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微生物发酵是一种经济高效、可持续的生产方式，可替代植物种植和化学合成来生产多种植物来源的药物。苄基异喹啉类生物碱作为植物来源生物碱的典型代表，具有多种重要的生理活性，已成为极具吸引力的微生物合成研究的靶标分子。随着该类生物碱天然生物合成途径逐渐被阐明以及多种酶学元件的发现，使得通过大肠杆菌和酿酒酵母等微生物宿主合成苄基异喹啉类生物碱的研究取得了重大进展。本综述着重介绍了这些进展中的突破性成果，包括苄基异喹啉类生物碱微生物合成过程中瓶颈反应的突破以及合成途径中相关酶的催化特性对代谢流的影响等，指出了微生物生产苄基异喹啉类生物碱走向工业化应用所面临的挑战，以及酶工程和新人工微生物合成途径的设计开发对克服这些挑战的重要性。

天然产物中炔基的生物合成机制研究及其应用

吕建明, 赵欢, 胡丹, 高昊

2021, 2(5): 734-750. doi:10.12211/2096-8280.2021-056

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炔基是许多药物、活性天然产物以及功能材料等的重要官能团，因此，开发高效的炔类化合物合成策略具有重要意义。传统的合成策略包括通过化学反应直接制备，或以简单的炔类前体为底物，通过生物转化获得。随着合成生物学技术的飞速发展，从头生物合成有望成为炔类化合物合成的新策略。该策略绿色环保，易于操作，是对传统化学合成以及生物转化策略的有效补充。炔类化合物从头生物合成的关键是阐明天然产物中炔基的生物合成机制，获得炔基合成酶。本文重点总结了不同天然产物中炔基的生物合成研究进展，包括脂肪酸、聚酮、聚酮-非核糖体肽杂合体、氨基酸以及杂萜，并介绍了炔基合成酶在炔类化合物从头生物合成中的应用。尽管炔基的生物合成研究近年来取得了长足发展，但在炔基合成酶的种类挖掘及其底物特异性拓展方面还有待进一步加强，从而为炔类化合物的从头生物合成提供更多可供选择的酶工具。

植物天然农药除虫菊酯的生物合成和应用研究进展

王凤姣, 徐海洋, 闫建斌, 李伟

2021, 2(5): 751-763. doi:10.12211/2096-8280.2021-068

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利用生物底盘进行生物农药的绿色低耗能生产是合成生物学未来发展的重要方向。除虫菊酯是一种源自菊科植物除虫菊的天然高效杀虫剂，具有广谱和强力的杀虫和驱虫作用，相较于化学合成的类似物（拟除虫菊酯），对哺乳动物毒性小，无环境危害，是生物农药的最优选择之一，具有广阔的应用前景。天然除虫菊酯含有六种主要成分，由两种异型萜类酸配体和茉莉酸合成途径来源的三种醇配体缩合而成。本文总结了除虫菊酯的研究历程，重点介绍了其生物合成途径解析与生物制造等方面的进展，综述了近期解析的细胞色素P450等相关生物合成酶，并讨论除虫菊酯生产中涉及的调控、转运和底盘适配等尚待解决的问题。随着合成生物学技术的发展，利用已解析的代谢合成途径在微生物等底盘表达体系规模化生产除虫菊酯，能够为合成生物学生产绿色生物农药的科学理论与应用实践提供重要范例。

乳蛋白重组表达与人造奶生物合成：全球专利分析与技术发展趋势

周正富, 庞雨, 张维, 王劲, 燕永亮, 郑迎迎, 陈敏, 廖志华, 林敏

2021, 2(5): 764-777. doi:10.12211/2096-8280.2021-057

摘要 ( 2324 )

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乳蛋白是天然动物奶的主要成分，具有高营养、易吸收、增强免疫力、抗氧化等多种生物活性。采用基因工程和细胞工厂等技术手段，高效表达天然奶中的各种乳蛋白组分，已成为当前人造奶生物合成的研发热点和技术难点。人造奶作为一个已商业化面向市场并正在改变世界的新兴科技食品，营养风味与天然牛奶相当，但不含乳糖、胆固醇、抗生素和致敏原等不良因子，其生产过程无需养殖动物，可以有效节约资源与能源，是一种颠覆传统养殖业的未来乳制品生产新模式，将引领未来食品产业和细胞农业发展方向。本文系统总结了模式微生物底盘改造、重组乳蛋白高效表达和人造奶制品产业化等相关核心技术的知识产权保护现状，探讨了目前人造奶制品研发面临的瓶颈技术挑战和生物安全评价等热点问题，介绍了乳蛋白组合表达、风味物质添加、致敏原删除和细胞工厂智造等最新发展动态，为人造奶等未来合成食品产业化提供重要的理论与技术参考。目前我国乳蛋白重组表达与人造奶生物合成技术研发力量相对薄弱，研发资金与风险投资不足。为应对日趋激烈的国际竞争，“十四五”期间我国应加大研发投入，着力突破共性关键技术与产品生产工艺，同时加快制定未来合成食品商业化管理法规与产业政策，为促进我国未来养殖业发展和实现农业碳达峰、碳中和目标提供的科技支撑。

解脂耶氏酵母中光控表达系统的构建及其应用研究

张萍, 魏文平, 周英, 叶邦策

2021, 2(5): 778-791. doi:10.12211/2096-8280.2021-018

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光作为诱导因子具有响应速度快、无损、可逆和独特的时空特异性等优势，已广泛应用于生物底盘细胞的工程化改造中。本研究构建重组解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的光控表达系统，成功实现了对香豆酸和柚皮素合成。该光控系统基于绿光响应调控因子CarH以及转录激活因子VPR-HSF1，构建了光响应复合体CarH-VPRH，而该复合体在绿光照射条件下无法聚合，从而不能调控目标基因的转录与表达。结果表明，基于光控因子CarH-VPRH、诱导型启动子2CarOTEF以及报告基因mCherry构建的光诱导传感器能够显著响应光照，并在黑暗条件下激活mCherry转录，72 h和120 h时产生的荧光信号分别是光照下的43倍和143倍。在此基础上，将该元件应用于对香豆酸及柚皮素的生物合成及合成途径的动态调控中，实现黑暗条件下的对香豆酸产量是绿光诱导下的2.0倍，达到99.1 mg/L；柚皮素产量是绿光诱导下的2.6倍达到117.1 mg/L；在细胞生长方面，绿光照射组的生长量高于黑暗组，特别是在绿光照射24 h，然后切换成黑暗条件，细胞的生长量有较为明显的优势，显示了绿光诱导系统在调控Y. lipolytica中产物合成与细胞生长平衡的潜力。因此该绿光响应基因调控系统可有效应用于Y. lipolytica细胞中目标基因的转录调控，具有廉价易得、无毒害、灵活添加及易去除等优势，因此具有大规模合成和生产目的产物的潜力。

构建酿酒酵母细胞工厂从头合成倍半萜类化合物α-新丁香三环烯和β-石竹烯

李晓东, 杨成帅, 王平平, 严兴, 周志华

2021, 2(5): 792-803. doi:10.12211/2096-8280.2021-014

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倍半萜类化合物（sesquiterpenoids）α-新丁香三环烯（α-neoclovene）和β-石竹烯（β-caryophyllene）都是人参挥发油中的主要组成成分，不仅具有重要的药用开发价值，而且在高能量密度生物能源的开发中也受到关注。然而，它们在人参和其他植物中含量均十分稀少且难以分离纯化，其开发与应用研究严重滞后。本研究利用天然产物合成生物学的方法，以BY4742为出发菌株构建了高产倍半萜类化合物前体FPP的通用底盘菌株SQTBY03。在此底盘菌株中异源表达了密码子优化的植物内生真菌Hypoxylon sp. EC38来源的多产物倍半萜合酶元件基因ec38-cs和黄花蒿（Artemisia annua）来源的倍半萜合酶元件基因QHS1，分别构建了合成α-新丁香三环烯和β-石竹烯的两个倍半萜细胞工厂NCVBY01和CPLBY01。细胞工厂NCVBY01的主要倍半萜产物为α-新丁香三环烯（>39%），细胞工厂CPLBY01的主要产物为β-石竹烯（>96%）。它们的摇瓶发酵产量分别达到25.8 mg/L和250.4 mg/L。通过在1.3 L发酵罐中进行批次补料发酵，细胞工厂NCVBY01合成α-新丁香三环烯的产量达到了487.1 mg/L，为目前首次在微生物细胞工厂中合成α-新丁香三环烯；CPLBY01合成β-石竹烯的产量达到2949.1 mg/L，为目前报道的最高水平。上述研究成果为α-新丁香三环烯和β-石竹烯的规模化制备提供新的途径。

Ⅱ型细胞色素P450酶氧化β-香树脂醇的选择性调控研究

孙文涛, 张昕哲, 万盛通, 王茹雯, 李春

2021, 2(5): 804-814. doi:10.12211/2096-8280.2021-081

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细胞色素P450酶（简称P450酶）是天然产物合成过程中的关键修饰酶，其催化的杂泛性使得一种生物合成途径中的一个P450酶可以氧化多个中间体导致多种结构类似物的产生。P450酶催化选择性的传统调控策略主要为催化结构域的改造以及氧化还原伴侣工程，然而在由P450酶、细胞色素P450还原酶（CPR）、生物膜构成的Ⅱ型P450酶催化系统中，蛋白跨膜域、膜组分的代谢等因素对其选择性的影响尚不清晰。为探索Ⅱ型P450酶催化选择性调控的新策略，解决甘草次酸合成过程中关键Ⅱ型P450酶CYP72A63（T338S）的底物选择性差而产生副产物11-脱氧甘草次酸的问题，本文通过在CYP72A63（T338S）的N端融合酵母内源P450酶以及其他内质网定位蛋白的跨膜域方式重塑CYP72A63（T338S）的跨膜结构，改造重要膜组分鞘脂的代谢途径，调节生物合成途径中具有底物竞争关系的P450酶表达比例的三种策略，以酿酒酵母为底盘菌株，通过体内验证的方式，探究了跨膜域、鞘脂代谢以及具有底物竞争关系的P450酶表达比例的变化对CYP72A63（T338S）催化特性的影响。结果表明，跨膜域的重塑以及鞘脂代谢的调节显著改变了CYP72A63（T338S）催化的底物选择性，N端跨膜域融合NTE1N以及敲除二氢鞘氨醇4-羟化酶的编码基因SUR2显著抑制了其对β-香树脂醇的氧化选择性；过表达来自毕赤酵母的葡萄糖神经酰胺合酶则会显著促进其对β-香树脂醇的氧化选择性；通过提高Uni25647（来源于乌拉尔甘草的11-氧-β-香树脂醇合成酶）的表达比例，促进了其与CYP72A63（T338S）竞争β-香树脂醇的能力，完全抑制了副产物11-脱氧甘草次酸的合成。本文为P450酶，尤其是膜定位的Ⅱ型P450酶催化特性调控的研究提供了新的思路和方法。

虫生真菌非核糖体多肽活性产物生物合成潜力预测

张礼文, MOLNÁR István, 徐玉泉

2021, 2(5): 815-825. doi:10.12211/2096-8280.2021-005

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肉座菌目虫生真菌合成的非核糖体多肽类天然产物具有抗菌、杀虫、抗癌、调节免疫等生物活性，在临床和农业等领域有重要应用价值。近年来，随着真菌基因组测序数量的迅速增加、注释和分析工具的不断进步，人们发现真菌基因组中存在大量产物未知的天然产物合成基因。准确有效地预测这些基因的功能，筛选最有潜力合成新颖天然产物的基因簇，可以提高天然产物挖掘的效率。本研究选取40株肉座菌目虫生真菌基因组，系统分析了编码非核糖体多肽合成酶的基因及基因簇。基于隐马尔可夫模型，预测了445个模块型非核糖体多肽合成酶和1243个类非核糖体多肽合成酶；通过提取腺苷酰化结构域，构建序列相似性网络，以已知功能的非核糖体多肽合成酶作为标签，利用马尔可夫聚类算法，分析了非核糖体多肽产物的主要类别，发现了可能合成线性多肽、环缩肽、脂多肽、生物碱等新型结构化合物的基因簇。研究结果不仅揭示了肉座菌目虫生真菌合成非核糖体多肽活性产物的巨大潜力，而且为通过激活沉默基因簇挖掘新产物、利用合成生物学手段改造合成途径提供参考。

环番合成酶PacB催化Xye类核糖体肽翻译后修饰研究

韩沅均, 莫天录, 邓子新, 张琪, 丁伟

2021, 2(5): 826-836. doi:10.12211/2096-8280.2021-080

摘要 ( 875 )

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近年来，一类含有分子内三残基环番结构的新型核糖体肽引起了广泛关注。这类化合物通常由一类S-腺苷甲硫氨酸自由基酶催化核心肽中芳香氨基酸的sp²碳和相邻第三位氨基酸残基侧链的sp³碳之间形成C—C或C—O键，这类酶被称为三残基环番合成酶（3-CyFEs）。目前发现Xye类核糖体肽天然产物生物合成基因簇中普遍含有此类三残基环番合成酶。本文报道从Photorhabdus australis DSM 17609中发现一个新的Xye类核糖体肽生物合成基因簇pac。异源表达和体外活性重建表明其生物合成基因簇编码的三残基环番合成酶PacB负责pacpeptide核心肽内的三个分子内环的生成。体内和体外实验结果初步表明PacB具有较高的底物容忍性，三个环番结构相互独立形成，但形成效率存在明显的差异，从而初步揭示了三个环番的形成顺序。本研究拓展了对Xye类核糖体肽化合物家族翻译后修饰以及三残基环番合成酶催化功能的了解。

利用异源表达挖掘纤维堆囊菌So0157-2的新型天然产物

周海波, 申琪瑶, 陈汉娜, 王宗杰, 李越中, 张友明, 卞小莹

2021, 2(5): 837-849. doi:10.12211/2096-8280.2021-024

摘要 ( 1310 )

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黏细菌是天然产物的重要来源。纤维堆囊菌So0157-2是抗癌药物埃博霉素的产生菌，并且是已知基因组最大的原核生物。生物信息学分析发现该菌一共含有35个次级代谢产物生物合成基因簇，除了已知的埃博霉素基因簇和其他两个萜类化合物生物合成基因簇与已知基因簇的相似度为100%之外，其他基因簇与已知化合物基因簇相似度均较低，其中包括17个聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）、非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）及其杂合的基因簇。由于纤维堆囊菌So0157-2生长缓慢、培养困难且难以在本源菌中进行遗传改造。因此，将其生物合成基因簇转移到简单宿主中，利用异源表达策略是挖掘该菌中新颖天然产物的一个有效途径。本文利用直接克隆技术从纤维堆囊菌So0157-2基因组DNA中克隆了1个包含NRPS和PKS结构域的基因簇BGC18，将其转移至伯克氏菌DSM 7029中进行异源表达。通过液质联用分析，色谱柱靶向分离纯化，进而通过NMR结构鉴定和Marfey反应确定了3个化合物分别为Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Val）（1）、Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Leu）（2）、Cyclo（N-Me-L-Leu-L-Ile）（3）。化合物结构的多样性来源于第1个腺苷化结构域对底物识别的宽泛性（Val/Leu/Ile）。生物合成途径分析推测由于缺少硫醇化结构域导致PKS模块被跳过，从而只获得了NRPS指导合成的环二肽产物1～3，这可能是细菌中一种实现化合物多样性的方式。本论文以基因簇直接克隆与异源表达相结合的策略，成功实现了一个来源于纤维堆囊菌So0157-2中的NRPS-PKS杂合基因簇的异源表达，分离并鉴定了3个该基因簇对应的表达产物。本研究为后续从该菌株中挖掘更多活性天然产物奠定了技术基础，也为其他难培养菌株的次级代谢产物的挖掘提供了思路。

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