Developing C1-based metabolic network in methylotrophy for biotransformation

doi:10.12211/2096-8280.2021-079

Abstract

Abstract:

One carbon (C₁) substrates have generated increasing attention as abundantly available feedstock for biotransformation to produce biofuels and valuable chemicals. Especially, these bioproducts are not only promoting the economic development, but also meet the societal needs for clean energy and environmental protection. Microbial cell factories (MCF) that efficiently convert raw materials to useful chemicals are highly desirable for C1 based biomanufacturing. Furthermore, more and more attention is being paid to study how the native and synthetic methylotrophic MCFs are capable of utilizing C1 compounds including methane, methanol, formic acid and carbon dioxide (CO₂) as raw materials for biosynthesis. Native methylotrophs have multiple pathways for C₁ utilization so that they can grow with methanol or formate as the sole carbon and energy source. Engineering synthetic methylotrophs are based on available metabolic knowledge and advanced genome engineering tools to modify the platform microorganisms. Hence, it is the key to explore the C₁-based metabolic networks of methylotrophy in depth for constructing highly effective methylotrophic cell factory to convert C₁ substrates. In this review, we firstly summarize in detail key natural pathways for C₁-substrate assimilation and bioproducts produced by native methylotrophs. Then we introduce synthetic methylotrophs and major chemical products derived through engineering Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum and Saccharomyces cerevisiae. In the field of synthetic methylotrophs, many studies focus on utilizing methanol or CO₂ as the sole carbon source and energy source to construct the MCFs for bio-transformation. In the end, we discuss the barriers and challenges for developing robust methylotrophic cell factory to convert C₁ substrates, and highlight strategies for commercializing the biotransformation of C₁ based substrates.

Key words: methylotrophs, one-carbon metabolism, C₁ compounds, biotransformation, metabolic engineering

摘要：

利用来源广、价格低、易制备且储量丰富的一碳化合物作为底物，通过构建甲基营养型细胞工厂，生物合成多种高附加值化学品，不仅可以促进一碳资源的洁净利用，同时可以缓解能源短缺、环境污染等问题。因此，深入了解甲基营养型微生物（天然型和合成型）的一碳代谢网络，是高效利用一碳化合物进行生物炼制的关键。本文综述了多种一碳化合物（甲烷、甲醇、甲酸和二氧化碳）生物炼制的研究进展，主要包括两个部分：（1）甲基营养型微生物（天然型和合成型）的关键代谢酶及多种代谢网络；（2）基于多种甲基营养型微生物进行生物合成的研究现状。文章最后讨论了一碳化合物作为底物进行生物转化所面临的主要瓶颈，并据此提供可行的研究策略，以期推动一碳化合物作为原材料进行生物炼制的工业化进程。

关键词: 甲基营养型微生物, 一碳代谢, 一碳化合物, 生物转化, 代谢工程

CLC Number:

Q 815

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102	BANG J, LEE S Y. Assimilation of formic acid and CO₂ by engineered Escherichia coliequipped with reconstructed one-carbon assimilation pathways[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(40): E9271-E9279.
103	BANG J, HWANG C H, AHN J H, et al. Escherichia coli is engineered to grow on CO₂ and formic acid[J]. Nature Microbiology, 2020, 5(12): 1459-1463.
104	SCHWANDER T, BORZYSKOWSKI L S VON, BURGENER S, et al. A synthetic pathway for the fixation of carbon dioxide in vitro [J]. Science, 2016, 354(6314): 900-904.
105	WITTHOFF S, MÜHLROTH A, MARIENHAGEN J, et al. C₁ metabolism in Corynebacterium glutamicum: an endogenous pathway for oxidation of methanol to carbon dioxide[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(22): 6974-6983.
106	YASOKAWA D, MURATA S, IWAHASHI Y, et al. Toxicity of methanol and formaldehyde towards Saccharomyces cerevisiae as assessed by DNA microarray analysis[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010, 160(6): 1685-1698.
107	DAI Z X, GU H L, ZHANG S J, et al. Metabolic construction strategies for direct methanol utilization in Saccharomyces cerevisiae [J]. Bioresource Technology, 2017, 245: 1407-1412.
108	ESPINOSA M I, WILLIAMS T C, PRETORIUS I S, et al. Benchmarking two Saccharomyces cerevisiae laboratory strains for growth and transcriptional response to methanol[J]. Synthetic and Systems Biotechnology, 2019, 4(4): 180-188.
109	ESPINOSA M I, GONZALEZ-GARCIA R A, VALGEPEA K, et al. Adaptive laboratory evolution of native methanol assimilation in Saccharomyces cerevisiae [J]. Nature Communications, 2020, 11: 5564.
110	GONZALEZ DE LA CRUZ J, MACHENS F, MESSERSCHMIDT K, et al. Core catalysis of the reductive glycine pathway demonstrated in yeast[J]. ACS Synthetic Biology, 2019, 8(5): 911-917.
111	袁姚梦, 邢新会, 张翀. 微生物细胞工厂的设计构建:从诱变育种到全基因组定制化创制[J]. 合成生物学, 2020, 1(6): 656-673.
	YUAN Y M, XING X H, ZHANG C. Progress and prospective of engineering microbial cell factories: from random mutagenesis to customized design in genome scale[J]. Synthetic Biology Journal, 2020, 1(6): 656-673.
112	YANG Y K, LIU G Q, CHEN X, et al. High efficiency CRISPR/Cas9 genome editing system with an eliminable episomal sgRNA plasmid in Pichia pastoris [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2020, 138: 109556.
113	WENINGER A, HATZL A M, SCHMID C, et al. Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9 expression enables precision genome engineering in the methylotrophic yeast Pichia pastoris [J]. Journal of Biotechnology, 2016, 235: 139-149.
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121	张卉, 袁姚梦, 张翀, 等. 合成甲基营养细胞工厂同化甲醇的研究进展及未来展望[J]. 合成生物学, 2021, 2(2): 222-233.
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122	HAMMER S K, AVALOS J L. Harnessing yeast organelles for metabolic engineering[J]. Nature Chemical Biology, 2017, 13(8): 823-832.

宿主	发酵培养基	产物（产量）	备注	参考文献
巴斯德毕赤酵母	甲醇，基础盐培养基	6-甲基水杨酸（2.2 g/L）	①表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（Aspergillus nidulans)、6-甲基水杨酸合成酶（Aspergillus terrus）；②5 L生物反应器	[15]
	甲醇，葡萄糖，基础盐培养基	香柏酮（208 mg/L）	①表达前二烯加氧酶（Hyoscyamus muticus）、细胞色素P450还原酶（Arabidopsis thaliana）、缬烯合酶（Callitropsis nootkatensis）、乙醇脱氢酶（Pichia pastoris）、部分羟基戊二酰辅酶A还原酶（Saccharomyces cerevisiae）；②补料分批	[16]
	葡萄糖（40 g/L），草酸（0.2 g/L），酵母提取物（7.5 g/L），蛋白胨（10 g/L），基础盐培养基	透明质酸（2.5 MDa；0.8～1.7 g/L）	①表达透明质酸合成酶2（Xenopus laevis）、UDP-葡萄糖脱氢酶（Xenopus laevis）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（P. pastoris）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（P. pastoris）、磷酸葡萄糖异构酶（P. pastoris）；②1 L生物反应器	[17]
	甲醇（1%），组氨酸（0.05%），生物素（0.01%）	富马酸（0.76 g/L），苹果酸（42.28 g/L），琥珀酸（9.42 g/L）	①表达丙酮酸羧化酶（Pichia pastoris）、苹果酸脱氢酶1（Pichia pastoris)、富马酸酶（Pichia pastoris）；②0.6 L生物反应器	[18]
	酵母提取物（1%），蛋白胨（2%），葡萄糖（2%）	番茄红素（1.141 μg/g细胞干重），β-胡萝卜素（339 μg/g细胞干重）	①表达香叶酰二磷酸合成酶（Erwinia uredovora）、茄红素合成酶（Erwinia uredovora）、茄红素去饱和酶（Erwinia uredovora）、番茄红素环化酶（Ficus carica）；②摇瓶培养	[19]
	甲醇（0.5%），甘油，基础盐培养基	单那可林 J（593.9 mg/L），洛伐他汀（250.8 mg/L）	①途径分割策略；②5 L生物反应器	[20]
	甲醇（0.5%），甘油，基础盐培养基	洛伐他汀（419 mg/L）	①表达洛伐他汀合成模块B-C-A-F-D-G（Aspergillus terreus）、细胞色素P450还原酶（Aspergillus terreus）、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（Aspergillus nidulans）、他汀外排蛋白（Aspergillus terreus）；②5 L生物反应器	[21]
汉逊酵母	甲醇（0.2%），胆碱（0.2%），葡萄糖（0.25%）	青霉素（1 mg/L）	①表达非核糖体肽合成酶（Penicillium chrysogenum）、异青霉素N合成酶（Penicillium chrysogenum）、异青霉素素N酰基转移酶（Penicillium chrysogenum）、苯乙酰CoA连接酶（Penicillium chrysogenum）；②恒化器	[22]
甲醇芽孢杆菌	甲醇，基础盐培养基	L-谷氨酸（58 g/L）	① 50 ℃培养；②补料分批	[23]
	甲醇（150 mmol/L），酵母提取物（0.25 g/L），基础盐培养基	L-赖氨酸（11 g/L）	①表达天冬氨酸激酶（Bacillus methanolicus）；② 3 L生物反应器	[24]
	甲醇（150 mmol/L），基础盐培养基	L-赖氨酸（65 g/L）， L-谷氨酸（28 g/L）	①表达丙酮酸羧化酶（Bacillus methanolicus）、高丝氨酸脱氢酶（Bacillus methanolicus）；②3 L生物反应器	[25]
	甲醇（200 mmol/L），酵母提取物（0.025%），基础盐培养基	L-赖氨酸（777 mg/L）	①表达赖氨酸外排基因（Corynebacterium glutamicum）；② 500 mL摇瓶发酵	[26]
	甲醇（200 mmol/L），酵母提取物（0.025%），基础盐培养基	尸胺（11.3 g/L）	①表达赖氨酸脱羧酶（Escherichia coli）；② 3 L生物反应器	[27]
	甲醇（200 mmol/L），诱导剂，基础盐培养基	尸胺（10.2 g/L）	①诱导的启动子系统和θ-and rolling circle-复制系统；② 3 L生物反应器	[28]
	甲醇（200 mmol/L），5'-磷酸吡哆醛（20 μmol/L），基础盐培养基	γ-氨基丁酸（9 g/L）	①表达谷氨酸脱羧酶（Sulfobacillus thermosulfidooxidans）；② 3 L生物反应器	[29]
扭脱甲基杆菌 AM1	甲醇（0.5%），琥珀酸（0.5%），基础盐培养基	聚羟基烷酸酯（PHA，35.1%±4.36%）	①表达PHA合成酶（Aeromonas caviae）；② Co²⁺缺陷条件；③摇瓶培养	[30]
	甲醇（125 mmol/L），琥珀酸（20 mmol/L），乙胺（20 mmol/L），基础盐培养基	1-丁醇（15.2 mg/L）	①表达烯酰辅酶A还原酶（Treponema denticola）、乙醇脱氢酶（Clostridium acetobutylicum）、巴豆酸酶（Methylobacterium extorquens AM1）；②摇瓶培养	[31]
	甲醇（240 mmol/L），基础盐培养基	衣康酸（31.6 mg/L± 5.5 mg/L）	①表达乌头酸脱羧酶（Aspergillus terreus）；② 2 L生物反应器	[32]
	甲醇（125 mmol/L），基础盐培养基	1-丁醇（25.5 mg/L)	①适应性进化筛选突变株耐受丁醇达到0.5%；②摇瓶培养	[33]
	甲醇（1%），基础盐培养基	甲羟戊酸（2.67 g/L）	①生物感应器辅助；②产率0.55 mol乙酰CoA/mol甲醇；③ 5 L-生物反应器	[34]
	甲醇（3 g/L），基础盐培养基	2-羟基异丁酸（2.1 g/L）	①表达(R)-3-羟基丁基辅酶A特异性辅酶B₁₂依赖性诱变酶（Bacillus massiliosenegalensis JC6）；②产率0.11 g/g甲醇，生物反应器	[35]
	甲醇（125 mmol/L），琥珀酸（15 mmol/L），基础盐培养基	3-羟基丙酸（69.8 mg/L）	①表达丙二酰辅酶A还原酶（Chlorofexus aurantiacus）；②摇瓶培养	[36]
	甲醇（0.5%），琥珀酸（15 mmol/L），基础盐培养基	3-羟基丙酸（0.857 g/L）	①ΔhprA，表达己糖磷酸合成酶（Bacillus methanolicus）、磷酸己糖异构酶（Bacillus methanolicus）、磷酸果糖激酶（Bacillus methanolicus）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Bacillus methanolicus）、丙二酰辅酶A还原酶（Chlorofexus aurantiacus）；② 2.5 L生物反应器	[37]
	甲醇（125 mmol/L），琥珀酸（15 mmol/L），基础盐培养基	异丁醇（19 mg/L）	①ΔldhA，表达2-酮异戊酸脱羧酶（Lactococcus lactis）、醇脱氢酶（Lactococcus lactis）、乙酰乳酸合酶（Bacillus subtilis）；②摇瓶培养	[38]
	甲醇（123 mmol/L），基础盐培养基	甲基富马酸，(2S)-甲基琥珀酸（0.65 g/L）	①ΔphaC，表达硫酯酶；②摇瓶培养；产率0.17 g/g甲醇；③钴缺陷条件	[39]
	甲醇（123 mmol/L），基础盐培养基	α-蛇麻烯（1.65 g/L）	①表达α-蛇麻烯合成酶（Zingiber zerumbet）、法尼焦磷酸合成酶（Saccharomyces cerevisiae)、异源甲羟戊酸途径；② 2.4 L生物反应器	[40]
	甲醇（1%），基础盐培养基	甲羟戊酸（2.22 g/L）	①表达HMG-CoA 合成酶（Enterococcus faecalistiters）、HMG-CoA还原酶（Enterococcus faecalistiters）、乙酰乙酰CoA 硫解酶（Ralstonia eutropha）；②产率28.4 mg/g甲醇，5 L生物反应器	[41]
	甲醇，琥珀酸盐，基础盐培养基	丁二烯前体（0.6 mg/L）	①表达羟乙烷基噻唑激酶（Escherichia coli）、磷酸异戊烯基激酶（Methanothermobacter thermautotrophicus）、乙醇脱氢酶（Clostridium acetobutylicum）；②摇瓶培养	[42]
扭脱甲基杆菌 ATCC 55366	甲醇，基础盐培养基	绿色荧光蛋白（4 g/L）	①表达不同的启动子；产率80 mg/g甲醇；② 20 L生物反应器	[43]
扭脱甲基杆菌 ATCC 55366	甲醇（1%），异丙基苯甲酸（20 mg/L），基础盐培养基	功能性聚羟基烷酸酯（PHA，35.1%±4.36%）	①表达聚羟基脂肪酸酯合成酶2（Pseudomonas fluorescens GK13）；②含有碳碳双键的功能性PHA；3.摇瓶培养	[44]
甲基杆菌 MB200	甲醇（1.2%），基础盐培养基	乙醛酸（14.38 mg/mL）	①表达羟基丙酮酸还原酶（M. extorquens）；②摇瓶培养	[45]
	甲醇（1.2%），基础盐培养基	L-丝氨酸（11.4 g/L）	①表达丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT，M. extorquens）；②静息发酵	[46]
	甲醇（1.2%），基础盐培养基	L-丝氨酸（6.6 g/L）	①表达甲醇脱氢酶（Methylobacterium sp. MB200）；②静息发酵	[47]
	甲醇（1.2%），基础盐培养基	L-丝氨酸（9.1 g/L）	Δgnd（6-磷酸葡萄糖脱氢酶）	[48]
甲基杆菌MB 126	甲醇（125 mmol/L），基础盐培养基	(R)-3-羟基丁酸（2.8 g/L）	① Δhbd（3-羟基丁酸降解酶）、Δlip（硫辛酸合成酶）② 2 L生物反应器	[49]
Protomonas extorquens NR-1	甲醇（1%），基础盐培养基	L-丝氨酸（54.5 g/L）	①静息发酵；② 2 L生物反应器，产率0.183 mol丝氨酸/mol甲醇	[50]
甲基菌属糖原ATCC突变体	甲醇（0.5%），蛋白胨（3 g/L），基础盐培养基	L-谷氨酸（38.3 g/L），L-苏氨酸（11 g/L），L-赖氨酸（5.6 g/L）	①NTG突变获取不同突变体，RV3、AL119、DHL122；② 5 L生物反应器	[51]
嗜甲基菌属 Methylotrophus	甲醇（500 mmol/L），硫酸铵	L-赖氨酸（112 mmol）	①表达ED 途径；② 1 L生物反应器	[52]
甲烷球菌属 Maripaludis	甲酸，乙酸（10 mmol/L），丙酮酸（20 mmol/L），丙氨酸（1 mmol/L），CO₂/H₂	香叶醇	①表达香叶醇合成酶（Ocimum basilicum）；② 产率4.6 mg/g甲酸	[53]

宿主	发酵培养基	产物（产量）	备注	参考文献
巴斯德毕赤酵母	甲醇，基础盐培养基	6-甲基水杨酸（2.2 g/L）	①表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（Aspergillus nidulans)、6-甲基水杨酸合成酶（Aspergillus terrus）；②5 L生物反应器	[15]
	甲醇，葡萄糖，基础盐培养基	香柏酮（208 mg/L）	①表达前二烯加氧酶（Hyoscyamus muticus）、细胞色素P450还原酶（Arabidopsis thaliana）、缬烯合酶（Callitropsis nootkatensis）、乙醇脱氢酶（Pichia pastoris）、部分羟基戊二酰辅酶A还原酶（Saccharomyces cerevisiae）；②补料分批	[16]
	葡萄糖（40 g/L），草酸（0.2 g/L），酵母提取物（7.5 g/L），蛋白胨（10 g/L），基础盐培养基	透明质酸（2.5 MDa；0.8～1.7 g/L）	①表达透明质酸合成酶2（Xenopus laevis）、UDP-葡萄糖脱氢酶（Xenopus laevis）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（P. pastoris）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（P. pastoris）、磷酸葡萄糖异构酶（P. pastoris）；②1 L生物反应器	[17]
	甲醇（1%），组氨酸（0.05%），生物素（0.01%）	富马酸（0.76 g/L），苹果酸（42.28 g/L），琥珀酸（9.42 g/L）	①表达丙酮酸羧化酶（Pichia pastoris）、苹果酸脱氢酶1（Pichia pastoris)、富马酸酶（Pichia pastoris）；②0.6 L生物反应器	[18]
	酵母提取物（1%），蛋白胨（2%），葡萄糖（2%）	番茄红素（1.141 μg/g细胞干重），β-胡萝卜素（339 μg/g细胞干重）	①表达香叶酰二磷酸合成酶（Erwinia uredovora）、茄红素合成酶（Erwinia uredovora）、茄红素去饱和酶（Erwinia uredovora）、番茄红素环化酶（Ficus carica）；②摇瓶培养	[19]
	甲醇（0.5%），甘油，基础盐培养基	单那可林 J（593.9 mg/L），洛伐他汀（250.8 mg/L）	①途径分割策略；②5 L生物反应器	[20]
	甲醇（0.5%），甘油，基础盐培养基	洛伐他汀（419 mg/L）	①表达洛伐他汀合成模块B-C-A-F-D-G（Aspergillus terreus）、细胞色素P450还原酶（Aspergillus terreus）、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（Aspergillus nidulans）、他汀外排蛋白（Aspergillus terreus）；②5 L生物反应器	[21]
汉逊酵母	甲醇（0.2%），胆碱（0.2%），葡萄糖（0.25%）	青霉素（1 mg/L）	①表达非核糖体肽合成酶（Penicillium chrysogenum）、异青霉素N合成酶（Penicillium chrysogenum）、异青霉素素N酰基转移酶（Penicillium chrysogenum）、苯乙酰CoA连接酶（Penicillium chrysogenum）；②恒化器	[22]
甲醇芽孢杆菌	甲醇，基础盐培养基	L-谷氨酸（58 g/L）	① 50 ℃培养；②补料分批	[23]
	甲醇（150 mmol/L），酵母提取物（0.25 g/L），基础盐培养基	L-赖氨酸（11 g/L）	①表达天冬氨酸激酶（Bacillus methanolicus）；② 3 L生物反应器	[24]
	甲醇（150 mmol/L），基础盐培养基	L-赖氨酸（65 g/L）， L-谷氨酸（28 g/L）	①表达丙酮酸羧化酶（Bacillus methanolicus）、高丝氨酸脱氢酶（Bacillus methanolicus）；②3 L生物反应器	[25]
	甲醇（200 mmol/L），酵母提取物（0.025%），基础盐培养基	L-赖氨酸（777 mg/L）	①表达赖氨酸外排基因（Corynebacterium glutamicum）；② 500 mL摇瓶发酵	[26]
	甲醇（200 mmol/L），酵母提取物（0.025%），基础盐培养基	尸胺（11.3 g/L）	①表达赖氨酸脱羧酶（Escherichia coli）；② 3 L生物反应器	[27]
	甲醇（200 mmol/L），诱导剂，基础盐培养基	尸胺（10.2 g/L）	①诱导的启动子系统和θ-and rolling circle-复制系统；② 3 L生物反应器	[28]
	甲醇（200 mmol/L），5'-磷酸吡哆醛（20 μmol/L），基础盐培养基	γ-氨基丁酸（9 g/L）	①表达谷氨酸脱羧酶（Sulfobacillus thermosulfidooxidans）；② 3 L生物反应器	[29]
扭脱甲基杆菌 AM1	甲醇（0.5%），琥珀酸（0.5%），基础盐培养基	聚羟基烷酸酯（PHA，35.1%±4.36%）	①表达PHA合成酶（Aeromonas caviae）；② Co²⁺缺陷条件；③摇瓶培养	[30]
	甲醇（125 mmol/L），琥珀酸（20 mmol/L），乙胺（20 mmol/L），基础盐培养基	1-丁醇（15.2 mg/L）	①表达烯酰辅酶A还原酶（Treponema denticola）、乙醇脱氢酶（Clostridium acetobutylicum）、巴豆酸酶（Methylobacterium extorquens AM1）；②摇瓶培养	[31]
	甲醇（240 mmol/L），基础盐培养基	衣康酸（31.6 mg/L± 5.5 mg/L）	①表达乌头酸脱羧酶（Aspergillus terreus）；② 2 L生物反应器	[32]
	甲醇（125 mmol/L），基础盐培养基	1-丁醇（25.5 mg/L)	①适应性进化筛选突变株耐受丁醇达到0.5%；②摇瓶培养	[33]
	甲醇（1%），基础盐培养基	甲羟戊酸（2.67 g/L）	①生物感应器辅助；②产率0.55 mol乙酰CoA/mol甲醇；③ 5 L-生物反应器	[34]
	甲醇（3 g/L），基础盐培养基	2-羟基异丁酸（2.1 g/L）	①表达(R)-3-羟基丁基辅酶A特异性辅酶B₁₂依赖性诱变酶（Bacillus massiliosenegalensis JC6）；②产率0.11 g/g甲醇，生物反应器	[35]
	甲醇（125 mmol/L），琥珀酸（15 mmol/L），基础盐培养基	3-羟基丙酸（69.8 mg/L）	①表达丙二酰辅酶A还原酶（Chlorofexus aurantiacus）；②摇瓶培养	[36]
	甲醇（0.5%），琥珀酸（15 mmol/L），基础盐培养基	3-羟基丙酸（0.857 g/L）	①ΔhprA，表达己糖磷酸合成酶（Bacillus methanolicus）、磷酸己糖异构酶（Bacillus methanolicus）、磷酸果糖激酶（Bacillus methanolicus）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（Bacillus methanolicus）、丙二酰辅酶A还原酶（Chlorofexus aurantiacus）；② 2.5 L生物反应器	[37]
	甲醇（125 mmol/L），琥珀酸（15 mmol/L），基础盐培养基	异丁醇（19 mg/L）	①ΔldhA，表达2-酮异戊酸脱羧酶（Lactococcus lactis）、醇脱氢酶（Lactococcus lactis）、乙酰乳酸合酶（Bacillus subtilis）；②摇瓶培养	[38]
	甲醇（123 mmol/L），基础盐培养基	甲基富马酸，(2S)-甲基琥珀酸（0.65 g/L）	①ΔphaC，表达硫酯酶；②摇瓶培养；产率0.17 g/g甲醇；③钴缺陷条件	[39]
	甲醇（123 mmol/L），基础盐培养基	α-蛇麻烯（1.65 g/L）	①表达α-蛇麻烯合成酶（Zingiber zerumbet）、法尼焦磷酸合成酶（Saccharomyces cerevisiae)、异源甲羟戊酸途径；② 2.4 L生物反应器	[40]
	甲醇（1%），基础盐培养基	甲羟戊酸（2.22 g/L）	①表达HMG-CoA 合成酶（Enterococcus faecalistiters）、HMG-CoA还原酶（Enterococcus faecalistiters）、乙酰乙酰CoA 硫解酶（Ralstonia eutropha）；②产率28.4 mg/g甲醇，5 L生物反应器	[41]
	甲醇，琥珀酸盐，基础盐培养基	丁二烯前体（0.6 mg/L）	①表达羟乙烷基噻唑激酶（Escherichia coli）、磷酸异戊烯基激酶（Methanothermobacter thermautotrophicus）、乙醇脱氢酶（Clostridium acetobutylicum）；②摇瓶培养	[42]
扭脱甲基杆菌 ATCC 55366	甲醇，基础盐培养基	绿色荧光蛋白（4 g/L）	①表达不同的启动子；产率80 mg/g甲醇；② 20 L生物反应器	[43]
扭脱甲基杆菌 ATCC 55366	甲醇（1%），异丙基苯甲酸（20 mg/L），基础盐培养基	功能性聚羟基烷酸酯（PHA，35.1%±4.36%）	①表达聚羟基脂肪酸酯合成酶2（Pseudomonas fluorescens GK13）；②含有碳碳双键的功能性PHA；3.摇瓶培养	[44]
甲基杆菌 MB200	甲醇（1.2%），基础盐培养基	乙醛酸（14.38 mg/mL）	①表达羟基丙酮酸还原酶（M. extorquens）；②摇瓶培养	[45]
	甲醇（1.2%），基础盐培养基	L-丝氨酸（11.4 g/L）	①表达丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT，M. extorquens）；②静息发酵	[46]
	甲醇（1.2%），基础盐培养基	L-丝氨酸（6.6 g/L）	①表达甲醇脱氢酶（Methylobacterium sp. MB200）；②静息发酵	[47]
	甲醇（1.2%），基础盐培养基	L-丝氨酸（9.1 g/L）	Δgnd（6-磷酸葡萄糖脱氢酶）	[48]
甲基杆菌MB 126	甲醇（125 mmol/L），基础盐培养基	(R)-3-羟基丁酸（2.8 g/L）	① Δhbd（3-羟基丁酸降解酶）、Δlip（硫辛酸合成酶）② 2 L生物反应器	[49]
Protomonas extorquens NR-1	甲醇（1%），基础盐培养基	L-丝氨酸（54.5 g/L）	①静息发酵；② 2 L生物反应器，产率0.183 mol丝氨酸/mol甲醇	[50]
甲基菌属糖原ATCC突变体	甲醇（0.5%），蛋白胨（3 g/L），基础盐培养基	L-谷氨酸（38.3 g/L），L-苏氨酸（11 g/L），L-赖氨酸（5.6 g/L）	①NTG突变获取不同突变体，RV3、AL119、DHL122；② 5 L生物反应器	[51]
嗜甲基菌属 Methylotrophus	甲醇（500 mmol/L），硫酸铵	L-赖氨酸（112 mmol）	①表达ED 途径；② 1 L生物反应器	[52]
甲烷球菌属 Maripaludis	甲酸，乙酸（10 mmol/L），丙酮酸（20 mmol/L），丙氨酸（1 mmol/L），CO₂/H₂	香叶醇	①表达香叶醇合成酶（Ocimum basilicum）；② 产率4.6 mg/g甲酸	[53]

宿主	主要途径	C₁底物	共培养底物	产品（产量）	特点	主要策略	参考文献
谷氨酸棒状杆菌	RuMP	甲醇	核糖（20/100 mmol/L）；葡萄糖（50 mmol/L）	尸胺（1.5 g/L）	首次将甲醇转化为非天然产物-尸胺	①表达RuMP相关酶；②Δald（乙醛脱氢酶），Δfadh（甲醛脱氢酶）；③表达赖氨酸脱羧酶（E. coli）	[75]
	RuMP	甲醇（15 g/L）	木糖（4 g/L）	L-谷氨酸（230 mg/L）	①甲醇是主要的碳源，甲醇和木糖的利用率达到7.04∶1；②进化菌株甲醇耐受浓度为15 g/L	①表达RuMP相关酶；②ΔAdhE（甲醛脱氢酶）、Δald（乙醛脱氢酶）、ΔrpiB（核糖磷酸异构酶）；③表达木酮糖激酶、木酮糖异构酶；④过表达PPP途径、ED途径相关酶	[76]
	RuMP	甲醇	木糖（4 g/L）	L-谷氨酸（90 mg/L）	①甲醇和木糖共利用可以明显提高细胞增长；②甲醇木糖利用率为3.83∶1；③胞内细胞¹³C甲醇标记度达到63%	①表达RuMP相关酶；②ΔAdhE（甲醛脱氢酶）、Δald（乙醛脱氢酶）；③表达木酮糖激酶、木酮糖异构酶；④ΔrpiB（核糖磷酸异构酶）	[77]
大肠杆菌	RuMP	甲醇（60 mmol/L）	葡萄糖、木糖、蛋白胨的混合物（1 g/L）；酵母提取物（1 g/L）	橘皮素（3.5 mg/L）	首次报道E. coli利用甲醇合成黄酮类物质	①表达RuMP相关酶；②ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；③表达香豆酰CoA连接酶、查尔酮合成酶	[66]
	RuMP	甲醇（6.4 g/L）	葡萄糖（30～100 g/L）、酵母提取物（1 g/L）；	琥珀酸（68.75 g/L）	①厌氧发酵加入甲醇提高琥珀酸产率0.98 g/g± 0.11 g/g甲醇；②甲醇氧化形成的NADH有助于琥珀酸形成	①表达RuMP相关酶；②5 L生物反应器	[78]
	MSC	甲醇（200 mmol/L）；甲酸（20 mmol/L）；CO₂	木糖（30 mmol/L）	乙醇（36 mmol/L）	①首次报道基于丝氨酸循环构建合成甲基营养菌；②甲醇加入可以增加乙醇产量达到62%，甲醇利用率为0.7 mmol/(L·h)(以OD₆₀₀计），木糖与甲醇消耗率为1∶0.7	①表达丝氨酸途径相关酶；②表达丙氨酸-乙醛酸转氨酶（Agt）、丝氨酸脱氢酶（Sdh）、苹果酸硫激酶（Mtk）、苹果酰CoA裂解酶（Mcl）等；③表达乙醛脱氢酶（Pdup）、乙醇脱氢酶（AdhB）；④ΔaceB ΔglcB ΔgcvP Δgcl ΔfrdB ΔldhA	[79]
	RuMP	甲醇	葡萄糖（30 g/L），酵母提取物（10 g/L）	丙酮（45.0 mmol/L ± 8.7 mmol/L）	①两种策略共同提高甲醇利用率；②E. coli利用甲醇合成丙酮	①Δpgi（6-磷酸葡萄糖异构酶）、ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；②表达RuMP途径相关酶；③表达磷酸核糖异构酶（rpe）、转酮酶（tkt）；④表达二磷酸果糖醛缩酶（fba）、景天庚糖双磷酸酶（glpX）、磷酸果糖激酶（pfk）	[74]
	RuMP	甲醇（3.2 g/L），甲醛（0.15 g/L）	葡萄糖（8～9 g/L），硫酸素焦磷酸盐（0.46 g/L）	1,3-丙二醇（508.3 mg/L ± 9.1 mg/L）	①首次实现利用甲醇和丙酮酸合成1,3-丙二醇；②缩短途径，并有效提高1,3-丙二醇产量	①表达甲醇脱氢酶；② ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；③表达羟丁酸醛缩酶、酮酸脱羧酶、1,3-丁二酸氧化还原酶	[80]
	HACL	甲醛		乙醇酸（1.2 g/L）	①首次报道HACL途径，可以转化甲酸和甲醛；②首次利用甲醛合成乙醇酸和羟基异丁酸	表达羟酰CoA裂解酶（RuHACLG390N，Rhodospirillales bacterium）、酰基CoA还原酶（LmACR，Listeria monocytogenes）	[81]
	RuMP	甲醇（250 mmol/L）	葡萄糖（10 g/L），酵母提取物（2 g/L）	丙酮（58 mmol/L）	①显著提升甲醇向丙酮的转化；②构建了甲醇依赖的菌株底盘	①Δpgi（6-磷酸葡萄糖异构酶）、Δedd（磷酸葡萄糖酸脱氢酶）、ΔrpiAB（核糖磷酸异构酶）、ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；②表达RuMP相关酶	[82]
	RuMP	甲醇（50～ 100 mmol/L）	葡萄糖（50 mmol/L），酵母提取物（1 g/L）	L-赖氨酸（0.1 g/L）	甲醇氧化所得的NADH转变为NADPH用于赖氨酸生产	①表达RuMP相关酶、ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；②表达Nudix水解酶、NADH激酶（POS5，Saccharomyces cerevisiae）；③表达赖氨酸合成途径相关酶（lysC, dapA, dapB）	[64]
	RuMP	甲醇	木糖，核糖	乙醇（4.6 g/L）； 1-丁醇（2 g/L）	①构建甲醇依赖型木糖菌株；②甲醇与木糖利用率为1∶1	①表达RuMP相关酶；②ΔAdhE（甲醛脱氢酶）、Δald（乙醛脱氢酶）、ΔrpiAB（核糖磷酸异构酶）；③表达腺苷酸环化酶	[83]

宿主	主要途径	C₁底物	共培养底物	产品（产量）	特点	主要策略	参考文献
谷氨酸棒状杆菌	RuMP	甲醇	核糖（20/100 mmol/L）；葡萄糖（50 mmol/L）	尸胺（1.5 g/L）	首次将甲醇转化为非天然产物-尸胺	①表达RuMP相关酶；②Δald（乙醛脱氢酶），Δfadh（甲醛脱氢酶）；③表达赖氨酸脱羧酶（E. coli）	[75]
	RuMP	甲醇（15 g/L）	木糖（4 g/L）	L-谷氨酸（230 mg/L）	①甲醇是主要的碳源，甲醇和木糖的利用率达到7.04∶1；②进化菌株甲醇耐受浓度为15 g/L	①表达RuMP相关酶；②ΔAdhE（甲醛脱氢酶）、Δald（乙醛脱氢酶）、ΔrpiB（核糖磷酸异构酶）；③表达木酮糖激酶、木酮糖异构酶；④过表达PPP途径、ED途径相关酶	[76]
	RuMP	甲醇	木糖（4 g/L）	L-谷氨酸（90 mg/L）	①甲醇和木糖共利用可以明显提高细胞增长；②甲醇木糖利用率为3.83∶1；③胞内细胞¹³C甲醇标记度达到63%	①表达RuMP相关酶；②ΔAdhE（甲醛脱氢酶）、Δald（乙醛脱氢酶）；③表达木酮糖激酶、木酮糖异构酶；④ΔrpiB（核糖磷酸异构酶）	[77]
大肠杆菌	RuMP	甲醇（60 mmol/L）	葡萄糖、木糖、蛋白胨的混合物（1 g/L）；酵母提取物（1 g/L）	橘皮素（3.5 mg/L）	首次报道E. coli利用甲醇合成黄酮类物质	①表达RuMP相关酶；②ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；③表达香豆酰CoA连接酶、查尔酮合成酶	[66]
	RuMP	甲醇（6.4 g/L）	葡萄糖（30～100 g/L）、酵母提取物（1 g/L）；	琥珀酸（68.75 g/L）	①厌氧发酵加入甲醇提高琥珀酸产率0.98 g/g± 0.11 g/g甲醇；②甲醇氧化形成的NADH有助于琥珀酸形成	①表达RuMP相关酶；②5 L生物反应器	[78]
	MSC	甲醇（200 mmol/L）；甲酸（20 mmol/L）；CO₂	木糖（30 mmol/L）	乙醇（36 mmol/L）	①首次报道基于丝氨酸循环构建合成甲基营养菌；②甲醇加入可以增加乙醇产量达到62%，甲醇利用率为0.7 mmol/(L·h)(以OD₆₀₀计），木糖与甲醇消耗率为1∶0.7	①表达丝氨酸途径相关酶；②表达丙氨酸-乙醛酸转氨酶（Agt）、丝氨酸脱氢酶（Sdh）、苹果酸硫激酶（Mtk）、苹果酰CoA裂解酶（Mcl）等；③表达乙醛脱氢酶（Pdup）、乙醇脱氢酶（AdhB）；④ΔaceB ΔglcB ΔgcvP Δgcl ΔfrdB ΔldhA	[79]
	RuMP	甲醇	葡萄糖（30 g/L），酵母提取物（10 g/L）	丙酮（45.0 mmol/L ± 8.7 mmol/L）	①两种策略共同提高甲醇利用率；②E. coli利用甲醇合成丙酮	①Δpgi（6-磷酸葡萄糖异构酶）、ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；②表达RuMP途径相关酶；③表达磷酸核糖异构酶（rpe）、转酮酶（tkt）；④表达二磷酸果糖醛缩酶（fba）、景天庚糖双磷酸酶（glpX）、磷酸果糖激酶（pfk）	[74]
	RuMP	甲醇（3.2 g/L），甲醛（0.15 g/L）	葡萄糖（8～9 g/L），硫酸素焦磷酸盐（0.46 g/L）	1,3-丙二醇（508.3 mg/L ± 9.1 mg/L）	①首次实现利用甲醇和丙酮酸合成1,3-丙二醇；②缩短途径，并有效提高1,3-丙二醇产量	①表达甲醇脱氢酶；② ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；③表达羟丁酸醛缩酶、酮酸脱羧酶、1,3-丁二酸氧化还原酶	[80]
	HACL	甲醛		乙醇酸（1.2 g/L）	①首次报道HACL途径，可以转化甲酸和甲醛；②首次利用甲醛合成乙醇酸和羟基异丁酸	表达羟酰CoA裂解酶（RuHACLG390N，Rhodospirillales bacterium）、酰基CoA还原酶（LmACR，Listeria monocytogenes）	[81]
	RuMP	甲醇（250 mmol/L）	葡萄糖（10 g/L），酵母提取物（2 g/L）	丙酮（58 mmol/L）	①显著提升甲醇向丙酮的转化；②构建了甲醇依赖的菌株底盘	①Δpgi（6-磷酸葡萄糖异构酶）、Δedd（磷酸葡萄糖酸脱氢酶）、ΔrpiAB（核糖磷酸异构酶）、ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；②表达RuMP相关酶	[82]
	RuMP	甲醇（50～ 100 mmol/L）	葡萄糖（50 mmol/L），酵母提取物（1 g/L）	L-赖氨酸（0.1 g/L）	甲醇氧化所得的NADH转变为NADPH用于赖氨酸生产	①表达RuMP相关酶、ΔfrmA（甲醛脱氢酶）；②表达Nudix水解酶、NADH激酶（POS5，Saccharomyces cerevisiae）；③表达赖氨酸合成途径相关酶（lysC, dapA, dapB）	[64]
	RuMP	甲醇	木糖，核糖	乙醇（4.6 g/L）； 1-丁醇（2 g/L）	①构建甲醇依赖型木糖菌株；②甲醇与木糖利用率为1∶1	①表达RuMP相关酶；②ΔAdhE（甲醛脱氢酶）、Δald（乙醛脱氢酶）、ΔrpiAB（核糖磷酸异构酶）；③表达腺苷酸环化酶	[83]

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Developing C₁-based metabolic network in methylotrophy for biotransformation

微生物中一碳代谢网络构建的进展与挑战

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