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Halogenases in Biocatalysis: Advances in Mechanism Elucidation， Directed Evolution， and Green Manufacturing
WANG Mingpeng, CHEN Lei, ZHAO Yiran, ZHANG Yimin, ZHENG Qifan, LIU Xinyang, WANG Yixue, WANG Qinhong
Synthetic Biology Journal    DOI: 10.12211/2096-8280.2024-091

Fig. 11 The action mode and engineering strategies of novel nucleotide halogenase [46]
Extracts from the Article
C2'位卤化修饰作为提升核苷酸类似物药物性质的关键策略，其酶催化实现途径备受关注。近期研究利用腺苷卤化酶AdeV实现了2'-脱氧腺苷-5'-单磷酸（dAMP）C2'位的直接卤化［45，70］，但该酶底物谱狭窄限制了其应用拓展。为突破这一瓶颈，Ni等［46］通过进化基因组学筛选获得新型2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸（dGMP）卤化酶CtNTH与VaNTH，其催化活性较AdeV提升43倍。尽管CtNTH与AdeV序列同源性达51%，两者却呈现显著底物偏好性差异。分子动力学模拟表明，核苷酸卤化酶的底物特异性由催化口袋中5'-磷酸基团结合模式决定，而非传统认知的碱基结合残基：CtNTH优先采用mode 1结合dGMP的磷酸基团，而AdeV倾向mode 2适配dAMP［图11（a）］。通过工程化磷酸结合位点SCS范围内的关键残基，成功实现了底物选择性的定向切换及酶动力学参数转变［图11（b）］。结构及动力学分析揭示，SCS通过调控磷酸结合位点模式（如氢键网络重构及静电势调整）精确控制底物取向。该研究不仅拓展了核苷酸卤化酶资源库，更为此类酶的理性设计改造提供了分子机制指导。
C2'位卤化修饰作为提升核苷酸类似物药物性质的关键策略，其酶催化实现途径备受关注.近期研究利用腺苷卤化酶AdeV实现了2'-脱氧腺苷-5'-单磷酸（dAMP）C2'位的直接卤化［45，70］，但该酶底物谱狭窄限制了其应用拓展.为突破这一瓶颈，Ni等［46］通过进化基因组学筛选获得新型2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸（dGMP）卤化酶CtNTH与VaNTH，其催化活性较AdeV提升43倍.尽管CtNTH与AdeV序列同源性达51%，两者却呈现显著底物偏好性差异.分子动力学模拟表明，核苷酸卤化酶的底物特异性由催化口袋中5'-磷酸基团结合模式决定，而非传统认知的碱基结合残基：CtNTH优先采用mode 1结合dGMP的磷酸基团，而AdeV倾向mode 2适配dAMP［图11（a）］.通过工程化磷酸结合位点SCS范围内的关键残基，成功实现了底物选择性的定向切换及酶动力学参数转变［图11（b）］.结构及动力学分析揭示，SCS通过调控磷酸结合位点模式（如氢键网络重构及静电势调整）精确控制底物取向.该研究不仅拓展了核苷酸卤化酶资源库，更为此类酶的理性设计改造提供了分子机制指导. ...

C2'位卤化修饰作为提升核苷酸类似物药物性质的关键策略，其酶催化实现途径备受关注.近期研究利用腺苷卤化酶AdeV实现了2'-脱氧腺苷-5'-单磷酸（dAMP）C2'位的直接卤化［45，70］，但该酶底物谱狭窄限制了其应用拓展.为突破这一瓶颈，Ni等［46］通过进化基因组学筛选获得新型2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸（dGMP）卤化酶CtNTH与VaNTH，其催化活性较AdeV提升43倍.尽管CtNTH与AdeV序列同源性达51%，两者却呈现显著底物偏好性差异.分子动力学模拟表明，核苷酸卤化酶的底物特异性由催化口袋中5'-磷酸基团结合模式决定，而非传统认知的碱基结合残基：CtNTH优先采用mode 1结合dGMP的磷酸基团，而AdeV倾向mode 2适配dAMP［图11（a）］.通过工程化磷酸结合位点SCS范围内的关键残基，成功实现了底物选择性的定向切换及酶动力学参数转变［图11（b）］.结构及动力学分析揭示，SCS通过调控磷酸结合位点模式（如氢键网络重构及静电势调整）精确控制底物取向.该研究不仅拓展了核苷酸卤化酶资源库，更为此类酶的理性设计改造提供了分子机制指导. ...
Copper-dependent halogenase catalyses unactivated C-H bond functionalization
5
2025
... 近期，唐奕课题组从Penicillium oxalicum中鉴定并表征了自由基卤化酶家族中的首个铜依赖型成员ApnU［81］.该酶的活性中心采用Cu2?取代传统的Fe2?辅因子，通过独特的金属配位结构和自由基介导机制实现C（sp3）-H的迭代卤化（图12）.在结构特征方面，ApnU含有两个HXXHC保守基序，形成一个由四个组氨酸侧链构成的平面位点（尺寸约5.4 ? × 6.1 ?）及两个半胱氨酸组成的铜结合位点，与NHFeHal的活性中心结构呈显著差异.功能研究表明，ApnU严格依赖Cu2?、O?以及抗坏血酸作为辅因子，能够催化天然底物atpenin B（1）在C5′位C（sp3 ）-H进行氯化反应，生成单氯（2）、二氯（3）和三氯产物（4），同时通过氢原子抽取机制产生脱氢副产物（5）.实验数据显示，ApnU的催化活性受NaCl浓度显著影响：当NaCl浓度为50 mM时氯化效率达到峰值，而在NaCl缺失条件下反应转向脱氢途径，这表明卤素配位在C-H键活化中起关键作用.与NHFeHal相比，ApnU表现出显著抑制羟基回弹副反应的能力，从而提升了卤代选择性，这一机制差异可能与金属中心的氧化还原特性相关.此外，ApnU展现出独特的广谱卤素兼容性，不仅能催化Cl?，还能利用Br?、I?、SCN?及SeCN?对天然底物（包括非天然底物DIF-3）进行C（sp3）-H官能化修饰，生成相应的单卤取代产物.基于软硬酸碱理论，Cu2?活性中心的较软特性使其能够高效结合较软的配体（如硫和碘），这一特性赋予ApnU催化C（sp3）-H碘化、硫氰化和硒氰化的独特能力，突破了NHFeHals仅能催化硬性卤素（Cl?/Br?）的限制，实现了C（sp3）-H的多样化修饰及软性卤素的高效利用.ApnU的发现不仅深化了对卤化酶金属依赖性的理解，更为复杂天然产物及药物中间体的生物合成提供了一种新型工具酶. ...

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