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Halogenases in Biocatalysis: Advances in Mechanism Elucidation， Directed Evolution， and Green Manufacturing
WANG Mingpeng, CHEN Lei, ZHAO Yiran, ZHANG Yimin, ZHENG Qifan, LIU Xinyang, WANG Yixue, WANG Qinhong
Synthetic Biology Journal    DOI: 10.12211/2096-8280.2024-091

卤化酶技术路线生产工艺或优化策略生产规模产品种类及产量文献
RebH异源共表达色氨酸酶/卤化酶/脱羧酶；谷氨酸棒状杆菌底盘；补料分批发酵2 L7-溴色胺: 0.36 g/L[135]

RebH

3-LSR

偶联L-氨基酸脱氨酶 (L-AAD) 构建FAD/FADH2再生系统纯酶或全细胞催化的7 -氯色氨酸和吲哚丙酮酸（IPA）的联合生产5L

7-Cl-Trp: 170 mg/L

IPA: 193 mg/L

[136]

Thal

RebH

PyrH

构建具有磷酸基脱氢酶和黄素还原酶活性的双功能融合酶用于FAD辅酶再生；共表达融合酶、卤化酶及双加氧酶；多酶固定化在单次培养条件下，高效实现一锅式固定化酶级联反应，用于大规模连续生产神经药物前药 L-4-氯犬尿氨酸（L-4-Cl-Kyn）及其非天然类似物 L-4-溴犬尿氨酸（L-4-Br-Kyn）2.5 L

L-4-Cl-Kyn: 701 mg

L-4-Br-Kyn: 805 mg

[137]

RebH

PrnA

SttH

PyrH

卤化酶催化的卤代反应与钯催化的氰化反应相结合以及随后与腈水合酶或腈水解酶进行级联反应生物-化学交叉偶联催化用于区域选择性碳氢键官能化以合成腈、酰胺和羧酸等基团，实现药物分子的克级制备30 ml-1 L芳酰胺类化合物8a: 1.98g[127]
WelO5*及其突变体算法辅助的理性设计与改造异源表达卤化酶；细胞裂解液催化广谱抗真菌剂索拉芬A（soraphen A）等大环内酯类化合物的卤化2 L氯化索拉芬2a（总转化数）:91.8±22.0[102]
Tab. 5 Recent cases and key data related to the potential industrial application of halogenases
Extracts from the Article
C2'位卤化修饰作为提升核苷酸类似物药物性质的关键策略，其酶催化实现途径备受关注。近期研究利用腺苷卤化酶AdeV实现了2'-脱氧腺苷-5'-单磷酸（dAMP）C2'位的直接卤化［45，70］，但该酶底物谱狭窄限制了其应用拓展。为突破这一瓶颈，Ni等［46］通过进化基因组学筛选获得新型2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸（dGMP）卤化酶CtNTH与VaNTH，其催化活性较AdeV提升43倍。尽管CtNTH与AdeV序列同源性达51%，两者却呈现显著底物偏好性差异。分子动力学模拟表明，核苷酸卤化酶的底物特异性由催化口袋中5'-磷酸基团结合模式决定，而非传统认知的碱基结合残基：CtNTH优先采用mode 1结合dGMP的磷酸基团，而AdeV倾向mode 2适配dAMP［图11（a）］。通过工程化磷酸结合位点SCS范围内的关键残基，成功实现了底物选择性的定向切换及酶动力学参数转变［图11（b）］。结构及动力学分析揭示，SCS通过调控磷酸结合位点模式（如氢键网络重构及静电势调整）精确控制底物取向。该研究不仅拓展了核苷酸卤化酶资源库，更为此类酶的理性设计改造提供了分子机制指导。
野生型AetF可以催化L-色氨酸的C5单溴化（5-Br-Trp，43%）和C5，C7二溴化（5，7-diBr-Trp，57%）。Dai等［97］以晶体结构为指导，定向改造AetF催化口袋，从而改变了底物偏好性。突变体D516A和S523A的主要产物仅为单溴化的5-Br-Trp（95%-98%）。结构分析和生化实验表明，AetF的杂泛性和二溴化能力可归因于宽敞的底物结合口袋。此外，底物识别残基与5-Br-Trp之间高度调控的相互作用网络对AetF的二溴化活性至关重要。这些结果首次揭示了ScFDH的催化机理，为后续FDH高效酶工程改造提供了依据。
Jiang等［89］通过多序列比对及丙氨酸扫描证实Tyr70是调控卤素选择性的关键残基。位点饱和实验显示Y70A/C/S/T/G突变体均获得氟化功能（其中Y70T/W129F双突变体使5′-FDA产量提升76%）。量子力学/分子力学（QM/MM）计算表明，突变体通过缩短F?与SAM-C5′的亲核距离（Δd≈0.67 ?）及降低反应能垒（ΔG?由38.0 kcal/mol降至12.0 kcal/mol）实现氟化功能。值得注意的是，引入FlA中氟离子结合关键残基Ser158的突变体G131S未表现活性，提示SalL的卤素选择性主要由Tyr70等催化口袋残基的静电微环境调控。
制药企业在工业生物催化技术发展中表现出强烈的前瞻性。早在2017年，诺华公司（Novartis AG）和先正达公司（Syngenta AG）便与苏黎世应用科学大学生物催化能力中心（CCBIO）展开合作，共同探索卤化酶工程改造在农业化学品及药物分子骨架卤化中的应用潜力［134］。近年来，酶促卤化技术的研发已成为化工、印染、农化等各个领域的关键技术需求。通过持续的基础研究积累，卤化酶技术取得了显著进展，部分研究成果展现出良好的工业化应用前景，相关技术的具体应用案例及关键数据分析如表5所示。
C2'位卤化修饰作为提升核苷酸类似物药物性质的关键策略，其酶催化实现途径备受关注.近期研究利用腺苷卤化酶AdeV实现了2'-脱氧腺苷-5'-单磷酸（dAMP）C2'位的直接卤化［45，70］，但该酶底物谱狭窄限制了其应用拓展.为突破这一瓶颈，Ni等［46］通过进化基因组学筛选获得新型2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸（dGMP）卤化酶CtNTH与VaNTH，其催化活性较AdeV提升43倍.尽管CtNTH与AdeV序列同源性达51%，两者却呈现显著底物偏好性差异.分子动力学模拟表明，核苷酸卤化酶的底物特异性由催化口袋中5'-磷酸基团结合模式决定，而非传统认知的碱基结合残基：CtNTH优先采用mode 1结合dGMP的磷酸基团，而AdeV倾向mode 2适配dAMP［图11（a）］.通过工程化磷酸结合位点SCS范围内的关键残基，成功实现了底物选择性的定向切换及酶动力学参数转变［图11（b）］.结构及动力学分析揭示，SCS通过调控磷酸结合位点模式（如氢键网络重构及静电势调整）精确控制底物取向.该研究不仅拓展了核苷酸卤化酶资源库，更为此类酶的理性设计改造提供了分子机制指导. ...

C2'位卤化修饰作为提升核苷酸类似物药物性质的关键策略，其酶催化实现途径备受关注.近期研究利用腺苷卤化酶AdeV实现了2'-脱氧腺苷-5'-单磷酸（dAMP）C2'位的直接卤化［45，70］，但该酶底物谱狭窄限制了其应用拓展.为突破这一瓶颈，Ni等［46］通过进化基因组学筛选获得新型2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸（dGMP）卤化酶CtNTH与VaNTH，其催化活性较AdeV提升43倍.尽管CtNTH与AdeV序列同源性达51%，两者却呈现显著底物偏好性差异.分子动力学模拟表明，核苷酸卤化酶的底物特异性由催化口袋中5'-磷酸基团结合模式决定，而非传统认知的碱基结合残基：CtNTH优先采用mode 1结合dGMP的磷酸基团，而AdeV倾向mode 2适配dAMP［图11（a）］.通过工程化磷酸结合位点SCS范围内的关键残基，成功实现了底物选择性的定向切换及酶动力学参数转变［图11（b）］.结构及动力学分析揭示，SCS通过调控磷酸结合位点模式（如氢键网络重构及静电势调整）精确控制底物取向.该研究不仅拓展了核苷酸卤化酶资源库，更为此类酶的理性设计改造提供了分子机制指导. ...
Copper-dependent halogenase catalyses unactivated C-H bond functionalization
5
2025
... 近期，唐奕课题组从Penicillium oxalicum中鉴定并表征了自由基卤化酶家族中的首个铜依赖型成员ApnU［81］.该酶的活性中心采用Cu2?取代传统的Fe2?辅因子，通过独特的金属配位结构和自由基介导机制实现C（sp3）-H的迭代卤化（图12）.在结构特征方面，ApnU含有两个HXXHC保守基序，形成一个由四个组氨酸侧链构成的平面位点（尺寸约5.4 ? × 6.1 ?）及两个半胱氨酸组成的铜结合位点，与NHFeHal的活性中心结构呈显著差异.功能研究表明，ApnU严格依赖Cu2?、O?以及抗坏血酸作为辅因子，能够催化天然底物atpenin B（1）在C5′位C（sp3 ）-H进行氯化反应，生成单氯（2）、二氯（3）和三氯产物（4），同时通过氢原子抽取机制产生脱氢副产物（5）.实验数据显示，ApnU的催化活性受NaCl浓度显著影响：当NaCl浓度为50 mM时氯化效率达到峰值，而在NaCl缺失条件下反应转向脱氢途径，这表明卤素配位在C-H键活化中起关键作用.与NHFeHal相比，ApnU表现出显著抑制羟基回弹副反应的能力，从而提升了卤代选择性，这一机制差异可能与金属中心的氧化还原特性相关.此外，ApnU展现出独特的广谱卤素兼容性，不仅能催化Cl?，还能利用Br?、I?、SCN?及SeCN?对天然底物（包括非天然底物DIF-3）进行C（sp3）-H官能化修饰，生成相应的单卤取代产物.基于软硬酸碱理论，Cu2?活性中心的较软特性使其能够高效结合较软的配体（如硫和碘），这一特性赋予ApnU催化C（sp3）-H碘化、硫氰化和硒氰化的独特能力，突破了NHFeHals仅能催化硬性卤素（Cl?/Br?）的限制，实现了C（sp3）-H的多样化修饰及软性卤素的高效利用.ApnU的发现不仅深化了对卤化酶金属依赖性的理解，更为复杂天然产物及药物中间体的生物合成提供了一种新型工具酶. ...

卤化酶则具备高度的专一性和选择性，可在温和条件下定向引入卤素基团，减少副反应，提高产率和纯度，为有机卤化物的合成提供了替代方案.此外，利用合成生物学手段将卤化酶引入酿酒酵母等工程微生物体系［112］，通过下游反应进一步改造修饰卤化中间产物，能够形成结构更为复杂的化合物，已成为分子合成领域新的发展趋势. ...
Structural and functional insights into the self-sufficient flavin-dependent halogenase
1
2024
... 野生型AetF可以催化L-色氨酸的C5单溴化（5-Br-Trp，43%）和C5，C7二溴化（5，7-diBr-Trp，57%）.Dai等［97］以晶体结构为指导，定向改造AetF催化口袋，从而改变了底物偏好性.突变体D516A和S523A的主要产物仅为单溴化的5-Br-Trp（95%-98%）.结构分析和生化实验表明，AetF的杂泛性和二溴化能力可归因于宽敞的底物结合口袋.此外，底物识别残基与5-Br-Trp之间高度调控的相互作用网络对AetF的二溴化活性至关重要.这些结果首次揭示了ScFDH的催化机理，为后续FDH高效酶工程改造提供了依据. ...
Increasing the stability of flavin-dependent halogenases by disulfide engineering
1
2024
... 为了扩大卤化酶的应用范围，需要在稳定性方面进行改进.先前对色氨酸6-卤化酶Thal的研究表明，耐高温的Thal变体倾向于在溶液中形成二聚体，而野生型则以单体形式存在.Besse等［98］利用在线工具Disulfide by Design 2.0设计了以二硫键共价连接的Thal二聚体变体.与野生型相比，在二聚体界面引入两个半胱氨酸残基（Val384C，Ala440C）形成的突变体Thal CC具有显著提高的热稳定性（?T50=15.7 K），并且催化活性及特异性均未受影响.此外，通过将同源突变引入色氨酸5-卤化酶PyrH，其热稳定性也进一步增强.因此，二硫化工程作为一种简单、高效的策略在未来卤化酶改造领域具有广泛应用前景. ...
Expression and characterization of PrnC-a flavin-dependent halogenase from the pyrrolnitrin biosynthetic pathway of Pseudomonas protegens Pf-5
2
2023
... 近年来，新的天然卤化酶及其工程化策略不断被发现和开发，代表了卤化酶改造领域的最新研究进展（表3）［81，99-103］. ...

当前，卤化酶研究领域已取得许多显著进展（图17），包括酶库容量的不断增长，催化性能的持续改善，反应机制的逐步揭示以及应用范围的大幅扩展，在药物合成、染料制备及有机化工等领域展现出独特潜力. ...
The single-component flavin reductase/flavin-dependent halogenase AetF is a versatile catalyst for selective bromination and iodination of arenes and olefins
1
2022
... Lewis课题组一直致力于FDHs的定向进化及其在合成应用方面的研究.在过去的几年里，该研究小组针对RebH卤化酶构建了一系列突变体［124］，并确定改造后的RebH可以催化包括去对称化反应、阻转选择性卤化和卤代环化反应在内的对映选择性反应（表4），其多样化的卤化产物为后续复杂分子的有机合成提供了丰富的骨架结构［125-127］.最近研究了单组分黄素依赖的卤化酶AetF的催化性能［128］.该酶不仅能选择性地对多种芳香族底物进行位点选择性的溴化和碘化，还能实现含有侧链羧酸或醇取代基的苯乙烯的对映选择性溴内酯化和碘醚化［129］.进一步研究表明，AetF能够催化多种1，1-二取代苯乙烯的卤化，通常具有较高的立体选择性［130］.此外，AetF还能卤化末端炔烃，尽管其催化效率低于JamD和MCE9［131］.通过突变体活性测试和氘同位素效应分析，研究支持了AetF通过共价催化机制实现炔烃卤化的假说.这些发现显著拓展了FDH催化的适用范围，并揭示了AetF在生物催化中的独特功能. ...
Expanding the reactivity of flavin-dependent halogenases toward olefins via enantioselective intramolecular haloetherification and chemoenzymatic oxidative rearrangements
1
2022
... Lewis课题组一直致力于FDHs的定向进化及其在合成应用方面的研究.在过去的几年里，该研究小组针对RebH卤化酶构建了一系列突变体［124］，并确定改造后的RebH可以催化包括去对称化反应、阻转选择性卤化和卤代环化反应在内的对映选择性反应（表4），其多样化的卤化产物为后续复杂分子的有机合成提供了丰富的骨架结构［125-127］.最近研究了单组分黄素依赖的卤化酶AetF的催化性能［128］.该酶不仅能选择性地对多种芳香族底物进行位点选择性的溴化和碘化，还能实现含有侧链羧酸或醇取代基的苯乙烯的对映选择性溴内酯化和碘醚化［129］.进一步研究表明，AetF能够催化多种1，1-二取代苯乙烯的卤化，通常具有较高的立体选择性［130］.此外，AetF还能卤化末端炔烃，尽管其催化效率低于JamD和MCE9［131］.通过突变体活性测试和氘同位素效应分析，研究支持了AetF通过共价催化机制实现炔烃卤化的假说.这些发现显著拓展了FDH催化的适用范围，并揭示了AetF在生物催化中的独特功能. ...
Selective C-H halogenation of alkenes and alkynes using flavin-dependent halogenases
1
2024
... Lewis课题组一直致力于FDHs的定向进化及其在合成应用方面的研究.在过去的几年里，该研究小组针对RebH卤化酶构建了一系列突变体［124］，并确定改造后的RebH可以催化包括去对称化反应、阻转选择性卤化和卤代环化反应在内的对映选择性反应（表4），其多样化的卤化产物为后续复杂分子的有机合成提供了丰富的骨架结构［125-127］.最近研究了单组分黄素依赖的卤化酶AetF的催化性能［128］.该酶不仅能选择性地对多种芳香族底物进行位点选择性的溴化和碘化，还能实现含有侧链羧酸或醇取代基的苯乙烯的对映选择性溴内酯化和碘醚化［129］.进一步研究表明，AetF能够催化多种1，1-二取代苯乙烯的卤化，通常具有较高的立体选择性［130］.此外，AetF还能卤化末端炔烃，尽管其催化效率低于JamD和MCE9［131］.通过突变体活性测试和氘同位素效应分析，研究支持了AetF通过共价催化机制实现炔烃卤化的假说.这些发现显著拓展了FDH催化的适用范围，并揭示了AetF在生物催化中的独特功能. ...
Enzymatic halogenation of terminal alkynes
1
2023
... Lewis课题组一直致力于FDHs的定向进化及其在合成应用方面的研究.在过去的几年里，该研究小组针对RebH卤化酶构建了一系列突变体［124］，并确定改造后的RebH可以催化包括去对称化反应、阻转选择性卤化和卤代环化反应在内的对映选择性反应（表4），其多样化的卤化产物为后续复杂分子的有机合成提供了丰富的骨架结构［125-127］.最近研究了单组分黄素依赖的卤化酶AetF的催化性能［128］.该酶不仅能选择性地对多种芳香族底物进行位点选择性的溴化和碘化，还能实现含有侧链羧酸或醇取代基的苯乙烯的对映选择性溴内酯化和碘醚化［129］.进一步研究表明，AetF能够催化多种1，1-二取代苯乙烯的卤化，通常具有较高的立体选择性［130］.此外，AetF还能卤化末端炔烃，尽管其催化效率低于JamD和MCE9［131］.通过突变体活性测试和氘同位素效应分析，研究支持了AetF通过共价催化机制实现炔烃卤化的假说.这些发现显著拓展了FDH催化的适用范围，并揭示了AetF在生物催化中的独特功能. ...
Controllable multi-halogenation of a non-native substrate by SyrB2 iron halogenase
1
2024
... 多卤化官能团在天然产物和药物中具有广泛存在，但选择性多卤化非活化C-H键仍面临挑战.NHFe/αKGHs为解决这一问题提供了新思路.Wilson等［132］利用SyrB2酶催化非天然底物α-氨基丁酸（Aba）的卤化，成功合成了单氯、二氯和三氯产物.特别值得注意的是，三氯产物的产量达到前所未有的数量级.这项研究还证实了SyrB2在多溴化反应中的应用潜力，并揭示了底物C-C键在催化位点的转动自由度对控制卤化程度的关键作用.这些结果表明，NHFe/αKGHs在多位点C-H功能化方面具有重要应用前景. ...
Unspecific Peroxygenase (UPO) can be Tuned for Oxygenation or Halogenation Activity by Controlling the Reaction pH
1
2024
... 非特异性过氧酶（UPOs）因其高稳定性和高活性，已成为选择性氧化反应领域的重要工具.与之结构相似的氯过氧化物酶（CPO）提示了UPOs可能具有卤化功能.Barber等［133］研究证明，通过调节pH值可控制UPO的卤化或氧化选择性.在pH 3.0和6.0条件下，分别实现了芳香化合物（如百里香酚）的溴化和氧化.该系统在100 mg制备规模下实现了60-72%的溴化产物收率.在4-乙基苯甲醚的溴化-氧合级联反应中，通过中途调节pH值（从3.0调整至6.0），成功合成了溴化-氧合产物1-（3-溴-4-甲氧基苯基）乙醇和3-溴-4-甲氧基苯乙酮，总转化率达到82%. ...
A collaborative journey towards the late-stage functionalization of added-value chemicals using engineered halogenases
1
2023
... 制药企业在工业生物催化技术发展中表现出强烈的前瞻性.早在2017年，诺华公司（Novartis AG）和先正达公司（Syngenta AG）便与苏黎世应用科学大学生物催化能力中心（CCBIO）展开合作，共同探索卤化酶工程改造在农业化学品及药物分子骨架卤化中的应用潜力［134］.近年来，酶促卤化技术的研发已成为化工、印染、农化等各个领域的关键技术需求.通过持续的基础研究积累，卤化酶技术取得了显著进展，部分研究成果展现出良好的工业化应用前景，相关技术的具体应用案例及关键数据分析如表5所示. ...
Fermentative production of halogenated tryptophan derivatives with Corynebacterium glutamicum overexpressing tryptophanase or decarboxylase genes
1
2022
... Recent cases and key data related to the potential industrial application of halogenases
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