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Halogenases in Biocatalysis: Advances in Mechanism Elucidation， Directed Evolution， and Green Manufacturing
WANG Mingpeng, CHEN Lei, ZHAO Yiran, ZHANG Yimin, ZHENG Qifan, LIU Xinyang, WANG Yixue, WANG Qinhong
Synthetic Biology Journal    DOI: 10.12211/2096-8280.2024-091

改造策略技术路线典型研究案例酶活改变动力学参数文献

反应条件

优化

可溶性表达系统；

温度/PH优化

PrnC在最适条件下实现1 h内对天然底物的100%转化生成氨基吡咯菌素（APRN），显著优于化学合成方法（10%转化率，副产物大量积累）＞600倍

KM = 14.40 ± 1.20 µM

kcat = 1.66 ± 0.02 min-1

[99]
定向进化底物结合口袋及C-端帽状区域关键残基定点突变多位点卤化酶FasV通过定点突变实现对底物特异性和区域选择性的可控催化未提及

KM: 24.1±14.2~205.9± 124.5 µM

kcat: (11.3±2.4)×10-2 ~(67.2±25.0)×10-2 min-1

[100]
计算辅助

序列比对；分子对接；

MD模拟；定点突变

核苷酸卤化酶CtNTH通过工程化磷酸结合位点关键残基簇（H247Y），成功实现底物选择性的定向切换38倍

KM = 0.23 ± 0.04 mM

kcat = 4.10± 0.2 min-1

[81]
光催化辅因子再生

蓝光照射光催化蛋白质内部

氧化型FAD还原再生；

时间分辨紫外-可见光谱

W281F突变使PrnH的量子转化效率提升41%，光还原速率接近游离FADox的57.5%，为光催化应用提供了优化方向未提及未提及[101]
机器学习辅助理性设计

智能文库设计；

ML指导虚拟筛选

ML指导下筛选的WelO5* VLA突变体催化大环内酯类非天然底物，TTN提高300倍以上，＞62倍

KM = 0.44±0.03 mM

kcat =1.96 ± 0.51 min-1

[102]

多酶自

组装

三酶组装元件构建；

自组装纳米簇（TESNCs）；

固定化

与游离酶相比，TESNCs 表现出更高的热稳定性和转化效率，6-Cl-L-Trp产量增加2.1倍；且固定化TESNCs后，6-Cl-L-Trp产量进一步提高4.2倍2倍

KM = 42.88 ± 12.22 µM

kcat =0.64 ± 0.03 min-1

[103]
Table 3 Typical engineering cases of natural halogenase in recent years
Extracts from the Article
近期，唐奕课题组从Penicillium oxalicum中鉴定并表征了自由基卤化酶家族中的首个铜依赖型成员ApnU［81］。该酶的活性中心采用Cu2?取代传统的Fe2?辅因子，通过独特的金属配位结构和自由基介导机制实现C（sp3）-H的迭代卤化（图12）。在结构特征方面，ApnU含有两个HXXHC保守基序，形成一个由四个组氨酸侧链构成的平面位点（尺寸约5.4 ? × 6.1 ?）及两个半胱氨酸组成的铜结合位点，与NHFeHal的活性中心结构呈显著差异。功能研究表明，ApnU严格依赖Cu2?、O?以及抗坏血酸作为辅因子，能够催化天然底物atpenin B（1）在C5′位C（sp3 ）-H进行氯化反应，生成单氯（2）、二氯（3）和三氯产物（4），同时通过氢原子抽取机制产生脱氢副产物（5）。实验数据显示，ApnU的催化活性受NaCl浓度显著影响：当NaCl浓度为50 mM时氯化效率达到峰值，而在NaCl缺失条件下反应转向脱氢途径，这表明卤素配位在C-H键活化中起关键作用。与NHFeHal相比，ApnU表现出显著抑制羟基回弹副反应的能力，从而提升了卤代选择性，这一机制差异可能与金属中心的氧化还原特性相关。此外，ApnU展现出独特的广谱卤素兼容性，不仅能催化Cl?，还能利用Br?、I?、SCN?及SeCN?对天然底物（包括非天然底物DIF-3）进行C（sp3）-H官能化修饰，生成相应的单卤取代产物。基于软硬酸碱理论，Cu2?活性中心的较软特性使其能够高效结合较软的配体（如硫和碘），这一特性赋予ApnU催化C（sp3）-H碘化、硫氰化和硒氰化的独特能力，突破了NHFeHals仅能催化硬性卤素（Cl?/Br?）的限制，实现了C（sp3）-H的多样化修饰及软性卤素的高效利用。ApnU的发现不仅深化了对卤化酶金属依赖性的理解，更为复杂天然产物及药物中间体的生物合成提供了一种新型工具酶。
近年来，新的天然卤化酶及其工程化策略不断被发现和开发，代表了卤化酶改造领域的最新研究进展（表3）［81，99-103］。
近期，唐奕课题组从Penicillium oxalicum中鉴定并表征了自由基卤化酶家族中的首个铜依赖型成员ApnU［81］.该酶的活性中心采用Cu2?取代传统的Fe2?辅因子，通过独特的金属配位结构和自由基介导机制实现C（sp3）-H的迭代卤化（图12）.在结构特征方面，ApnU含有两个HXXHC保守基序，形成一个由四个组氨酸侧链构成的平面位点（尺寸约5.4 ? × 6.1 ?）及两个半胱氨酸组成的铜结合位点，与NHFeHal的活性中心结构呈显著差异.功能研究表明，ApnU严格依赖Cu2?、O?以及抗坏血酸作为辅因子，能够催化天然底物atpenin B（1）在C5′位C（sp3 ）-H进行氯化反应，生成单氯（2）、二氯（3）和三氯产物（4），同时通过氢原子抽取机制产生脱氢副产物（5）.实验数据显示，ApnU的催化活性受NaCl浓度显著影响：当NaCl浓度为50 mM时氯化效率达到峰值，而在NaCl缺失条件下反应转向脱氢途径，这表明卤素配位在C-H键活化中起关键作用.与NHFeHal相比，ApnU表现出显著抑制羟基回弹副反应的能力，从而提升了卤代选择性，这一机制差异可能与金属中心的氧化还原特性相关.此外，ApnU展现出独特的广谱卤素兼容性，不仅能催化Cl?，还能利用Br?、I?、SCN?及SeCN?对天然底物（包括非天然底物DIF-3）进行C（sp3）-H官能化修饰，生成相应的单卤取代产物.基于软硬酸碱理论，Cu2?活性中心的较软特性使其能够高效结合较软的配体（如硫和碘），这一特性赋予ApnU催化C（sp3）-H碘化、硫氰化和硒氰化的独特能力，突破了NHFeHals仅能催化硬性卤素（Cl?/Br?）的限制，实现了C（sp3）-H的多样化修饰及软性卤素的高效利用.ApnU的发现不仅深化了对卤化酶金属依赖性的理解，更为复杂天然产物及药物中间体的生物合成提供了一种新型工具酶. ...

近期，唐奕课题组从Penicillium oxalicum中鉴定并表征了自由基卤化酶家族中的首个铜依赖型成员ApnU［81］.该酶的活性中心采用Cu2?取代传统的Fe2?辅因子，通过独特的金属配位结构和自由基介导机制实现C（sp3）-H的迭代卤化（图12）.在结构特征方面，ApnU含有两个HXXHC保守基序，形成一个由四个组氨酸侧链构成的平面位点（尺寸约5.4 ? × 6.1 ?）及两个半胱氨酸组成的铜结合位点，与NHFeHal的活性中心结构呈显著差异.功能研究表明，ApnU严格依赖Cu2?、O?以及抗坏血酸作为辅因子，能够催化天然底物atpenin B（1）在C5′位C（sp3 ）-H进行氯化反应，生成单氯（2）、二氯（3）和三氯产物（4），同时通过氢原子抽取机制产生脱氢副产物（5）.实验数据显示，ApnU的催化活性受NaCl浓度显著影响：当NaCl浓度为50 mM时氯化效率达到峰值，而在NaCl缺失条件下反应转向脱氢途径，这表明卤素配位在C-H键活化中起关键作用.与NHFeHal相比，ApnU表现出显著抑制羟基回弹副反应的能力，从而提升了卤代选择性，这一机制差异可能与金属中心的氧化还原特性相关.此外，ApnU展现出独特的广谱卤素兼容性，不仅能催化Cl?，还能利用Br?、I?、SCN?及SeCN?对天然底物（包括非天然底物DIF-3）进行C（sp3）-H官能化修饰，生成相应的单卤取代产物.基于软硬酸碱理论，Cu2?活性中心的较软特性使其能够高效结合较软的配体（如硫和碘），这一特性赋予ApnU催化C（sp3）-H碘化、硫氰化和硒氰化的独特能力，突破了NHFeHals仅能催化硬性卤素（Cl?/Br?）的限制，实现了C（sp3）-H的多样化修饰及软性卤素的高效利用.ApnU的发现不仅深化了对卤化酶金属依赖性的理解，更为复杂天然产物及药物中间体的生物合成提供了一种新型工具酶. ...
Regioselective halogenation of lavanducyanin by a site-selective vanadium-dependent chloroperoxidase
1
2024
... 此外，非血红素铁/α-酮戊二酸依赖型卤化酶家族也增添了新成员AdeV和CtNTH，分别催化2'-脱氧腺苷-5'-单磷酸（dAMP）和2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸（dGMP）的氯化［45-46］.这些核苷酸卤化酶的发现扩大了卤化酶家族可催化底物的范围.Baumgartner和McKinnie报道第一个以吩嗪酮为底物的新型卤化酶LvcH，属于VHPO家族［47］. ...
UniProt: the universal protein knowledgebase in 2021
1
2021
... 随着DNA测序技术的发展，特别是基因组学和宏基因组学工具的发展，人们发现了大量的蛋白质序列.然而，目前科学家只对蛋白质序列总量的0.3% （约50万）进行过研究，其中有明确实验证据支持的序列占比不足20%（<19.4%）［48-50］.另一方面，蛋白质功能注释高度依赖于计算模型的运行方式.一项大规模的蛋白质功能注释关键评估（CAFA）研究发现，使用现有计算工具自动注释的酶中有40%是不正确的［50］.因此，从有限的实验数据基础上对未知或未表征酶进行准确功能注释预测，对于蛋白质序列数据分析处理和应用至关重要.为了突破已有方法的局限性（表2），赵惠民团队开发了一种基于对比学习的机器学习模型CLEAN（Contrastive Learning-enabled Enzyme ANnotation）［51］.在CLEAN的任务中，具有相同酶分类编号（EC，Enzyme commission，指示酶催化何种反应的ID代码）的氨基酸序列具有较小的欧氏距离，反映了功能相似性.CLEAN基于UniProt的高质量数据库进行训练，输入氨基酸序列，随后计算对比输入样本间的欧式距离，就可得到EC可能性排序列表.为了验证CLEAN的准确性和稳健性，针对UniProt数据库中样本有限，研究不足的卤化酶数据集，使用CLEAN及其他六种最先进的注释工具（ProteInfer、BLASTp、DeepEC、DEEPre、COFACTOR和ECPred）对36种未完全注释的卤化酶的EC编号进行重新分配，结合实验验证结果，综合表明CLEAN（预测精度86.7至100%）在酶功能预测任务中比其他工具（例如，DeepEC中约11.1%，ProteInfer中11.1至61.1%）更具优越性.此外，所有预测工具中只有CLEAN成功将原本功能注释不准确甚至相互矛盾的卤化酶MJ1651（EC 3.13.1.8）和TTHA0338（EC 3.13.1.8）精准区分，并准确识别SsFlA多功能酶具备三种催化能力（EC 2.5.1.63， EC 2.5.1.94和EC 3.13.1.8）.结果表明，CLEAN能够高效处理低相似性序列、数据不平衡及混杂酶等复杂数据集，预测准确率显著提升并兼具抗噪性和纠错能力，为酶功能注释提供高精度、强鲁棒的计算工具.此外，该项工作证实了机器学习等AI技术在卤化酶识别、分类、鉴定方面的高效性和准确性，具有巨大应用潜力. ...
An unusual aromatase/cyclase programs the formation of the phenyldimethylanthrone framework in anthrabenzoxocinones and fasamycin
0
2024
A large-scale evaluation of computational protein function prediction
2
2013
... 随着DNA测序技术的发展，特别是基因组学和宏基因组学工具的发展，人们发现了大量的蛋白质序列.然而，目前科学家只对蛋白质序列总量的0.3% （约50万）进行过研究，其中有明确实验证据支持的序列占比不足20%（<19.4%）［48-50］.另一方面，蛋白质功能注释高度依赖于计算模型的运行方式.一项大规模的蛋白质功能注释关键评估（CAFA）研究发现，使用现有计算工具自动注释的酶中有40%是不正确的［50］.因此，从有限的实验数据基础上对未知或未表征酶进行准确功能注释预测，对于蛋白质序列数据分析处理和应用至关重要.为了突破已有方法的局限性（表2），赵惠民团队开发了一种基于对比学习的机器学习模型CLEAN（Contrastive Learning-enabled Enzyme ANnotation）［51］.在CLEAN的任务中，具有相同酶分类编号（EC，Enzyme commission，指示酶催化何种反应的ID代码）的氨基酸序列具有较小的欧氏距离，反映了功能相似性.CLEAN基于UniProt的高质量数据库进行训练，输入氨基酸序列，随后计算对比输入样本间的欧式距离，就可得到EC可能性排序列表.为了验证CLEAN的准确性和稳健性，针对UniProt数据库中样本有限，研究不足的卤化酶数据集，使用CLEAN及其他六种最先进的注释工具（ProteInfer、BLASTp、DeepEC、DEEPre、COFACTOR和ECPred）对36种未完全注释的卤化酶的EC编号进行重新分配，结合实验验证结果，综合表明CLEAN（预测精度86.7至100%）在酶功能预测任务中比其他工具（例如，DeepEC中约11.1%，ProteInfer中11.1至61.1%）更具优越性.此外，所有预测工具中只有CLEAN成功将原本功能注释不准确甚至相互矛盾的卤化酶MJ1651（EC 3.13.1.8）和TTHA0338（EC 3.13.1.8）精准区分，并准确识别SsFlA多功能酶具备三种催化能力（EC 2.5.1.63， EC 2.5.1.94和EC 3.13.1.8）.结果表明，CLEAN能够高效处理低相似性序列、数据不平衡及混杂酶等复杂数据集，预测准确率显著提升并兼具抗噪性和纠错能力，为酶功能注释提供高精度、强鲁棒的计算工具.此外，该项工作证实了机器学习等AI技术在卤化酶识别、分类、鉴定方面的高效性和准确性，具有巨大应用潜力. ...

C2'位卤化修饰作为提升核苷酸类似物药物性质的关键策略，其酶催化实现途径备受关注.近期研究利用腺苷卤化酶AdeV实现了2'-脱氧腺苷-5'-单磷酸（dAMP）C2'位的直接卤化［45，70］，但该酶底物谱狭窄限制了其应用拓展.为突破这一瓶颈，Ni等［46］通过进化基因组学筛选获得新型2'-脱氧鸟苷-5'-单磷酸（dGMP）卤化酶CtNTH与VaNTH，其催化活性较AdeV提升43倍.尽管CtNTH与AdeV序列同源性达51%，两者却呈现显著底物偏好性差异.分子动力学模拟表明，核苷酸卤化酶的底物特异性由催化口袋中5'-磷酸基团结合模式决定，而非传统认知的碱基结合残基：CtNTH优先采用mode 1结合dGMP的磷酸基团，而AdeV倾向mode 2适配dAMP［图11（a）］.通过工程化磷酸结合位点SCS范围内的关键残基，成功实现了底物选择性的定向切换及酶动力学参数转变［图11（b）］.结构及动力学分析揭示，SCS通过调控磷酸结合位点模式（如氢键网络重构及静电势调整）精确控制底物取向.该研究不仅拓展了核苷酸卤化酶资源库，更为此类酶的理性设计改造提供了分子机制指导. ...
Copper-dependent halogenase catalyses unactivated C-H bond functionalization
5
2025
... 近期，唐奕课题组从Penicillium oxalicum中鉴定并表征了自由基卤化酶家族中的首个铜依赖型成员ApnU［81］.该酶的活性中心采用Cu2?取代传统的Fe2?辅因子，通过独特的金属配位结构和自由基介导机制实现C（sp3）-H的迭代卤化（图12）.在结构特征方面，ApnU含有两个HXXHC保守基序，形成一个由四个组氨酸侧链构成的平面位点（尺寸约5.4 ? × 6.1 ?）及两个半胱氨酸组成的铜结合位点，与NHFeHal的活性中心结构呈显著差异.功能研究表明，ApnU严格依赖Cu2?、O?以及抗坏血酸作为辅因子，能够催化天然底物atpenin B（1）在C5′位C（sp3 ）-H进行氯化反应，生成单氯（2）、二氯（3）和三氯产物（4），同时通过氢原子抽取机制产生脱氢副产物（5）.实验数据显示，ApnU的催化活性受NaCl浓度显著影响：当NaCl浓度为50 mM时氯化效率达到峰值，而在NaCl缺失条件下反应转向脱氢途径，这表明卤素配位在C-H键活化中起关键作用.与NHFeHal相比，ApnU表现出显著抑制羟基回弹副反应的能力，从而提升了卤代选择性，这一机制差异可能与金属中心的氧化还原特性相关.此外，ApnU展现出独特的广谱卤素兼容性，不仅能催化Cl?，还能利用Br?、I?、SCN?及SeCN?对天然底物（包括非天然底物DIF-3）进行C（sp3）-H官能化修饰，生成相应的单卤取代产物.基于软硬酸碱理论，Cu2?活性中心的较软特性使其能够高效结合较软的配体（如硫和碘），这一特性赋予ApnU催化C（sp3）-H碘化、硫氰化和硒氰化的独特能力，突破了NHFeHals仅能催化硬性卤素（Cl?/Br?）的限制，实现了C（sp3）-H的多样化修饰及软性卤素的高效利用.ApnU的发现不仅深化了对卤化酶金属依赖性的理解，更为复杂天然产物及药物中间体的生物合成提供了一种新型工具酶. ...

卤化酶则具备高度的专一性和选择性，可在温和条件下定向引入卤素基团，减少副反应，提高产率和纯度，为有机卤化物的合成提供了替代方案.此外，利用合成生物学手段将卤化酶引入酿酒酵母等工程微生物体系［112］，通过下游反应进一步改造修饰卤化中间产物，能够形成结构更为复杂的化合物，已成为分子合成领域新的发展趋势. ...
Structural and functional insights into the self-sufficient flavin-dependent halogenase
1
2024
... 野生型AetF可以催化L-色氨酸的C5单溴化（5-Br-Trp，43%）和C5，C7二溴化（5，7-diBr-Trp，57%）.Dai等［97］以晶体结构为指导，定向改造AetF催化口袋，从而改变了底物偏好性.突变体D516A和S523A的主要产物仅为单溴化的5-Br-Trp（95%-98%）.结构分析和生化实验表明，AetF的杂泛性和二溴化能力可归因于宽敞的底物结合口袋.此外，底物识别残基与5-Br-Trp之间高度调控的相互作用网络对AetF的二溴化活性至关重要.这些结果首次揭示了ScFDH的催化机理，为后续FDH高效酶工程改造提供了依据. ...
Increasing the stability of flavin-dependent halogenases by disulfide engineering
1
2024
... 为了扩大卤化酶的应用范围，需要在稳定性方面进行改进.先前对色氨酸6-卤化酶Thal的研究表明，耐高温的Thal变体倾向于在溶液中形成二聚体，而野生型则以单体形式存在.Besse等［98］利用在线工具Disulfide by Design 2.0设计了以二硫键共价连接的Thal二聚体变体.与野生型相比，在二聚体界面引入两个半胱氨酸残基（Val384C，Ala440C）形成的突变体Thal CC具有显著提高的热稳定性（?T50=15.7 K），并且催化活性及特异性均未受影响.此外，通过将同源突变引入色氨酸5-卤化酶PyrH，其热稳定性也进一步增强.因此，二硫化工程作为一种简单、高效的策略在未来卤化酶改造领域具有广泛应用前景. ...
Expression and characterization of PrnC-a flavin-dependent halogenase from the pyrrolnitrin biosynthetic pathway of Pseudomonas protegens Pf-5
2
2023
... 近年来，新的天然卤化酶及其工程化策略不断被发现和开发，代表了卤化酶改造领域的最新研究进展（表3）［81，99-103］. ...

当前，卤化酶研究领域已取得许多显著进展（图17），包括酶库容量的不断增长，催化性能的持续改善，反应机制的逐步揭示以及应用范围的大幅扩展，在药物合成、染料制备及有机化工等领域展现出独特潜力. ...
Protein scaffold-mediated multi-enzyme self-assembly and ordered co-immobilization of flavin-dependent halogenase-coenzyme cycle system for efficient biosynthesis of 6‐Cl‐L‐Trp
3
2025
... 近年来，新的天然卤化酶及其工程化策略不断被发现和开发，代表了卤化酶改造领域的最新研究进展（表3）［81，99-103］. ...

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